[发明专利]GMP级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法

权利要求书

1.一种无血清悬浮细胞生产慢病毒的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一种用于生产慢病毒的包装细胞的种子液，所述的包装细胞是悬浮生长的包装细胞；

(b)将所述种子液接种于置于培养容器中的第一培养液中，获得第一培养物，其中，所述的第一培养液是无血清的细胞培养液，并且接种密度为1×10⁶-5×10⁶细胞/ml，并且第一培养液的体积为3-100升(较佳地5-50升)；

(c)对所述第一培养物进行包装细胞的传代培养，其中，传代培养的条件设定为在温度为30～38℃，溶氧为35～55％，CO₂浓度为2～10％和pH 6.9-7.4下进行，并且在所述传代培养过程中，监控所述第一培养物的实时pH值，并基于所述实时pH值对溶氧和/或CO₂浓度进行控制，从而维持pH在6.9-7.4之间；

(d)当满足换液触发条件时，启动换液操作，

其中，所述的换液触发条件包括：

(s1)实时pH≤6.9，较佳地≤7.0，较佳地≤7.05；

(s2)通过调控氧气、空气、氮气和/或CO₂浓度，实时pH值仍呈现下降趋势；和

(s3)传代培养时间≥72小时；

其中，所述换液操作包括：将位于所述培养物的无细胞清液从所述培养容器中排出，其中排出清液前所述培养物的体积为Vq1，而排出清液后所述培养物的体积为Vh1，则Vq1/Vh1之比为3-15(较佳地4-7，更佳地5-6)；然后，向所述培养容器中补加培养液，形成包装细胞培养物；

(e)重复步骤(c)和(d)n次，n为1、2、或3次；

(f)当满足转染触发条件时，启动转染操作，

其中，所述的转染触发条件包括：

(t1)细胞总量为0.05～2×10¹¹个细胞；

(t2)细胞密度为0.5～5×10⁶个细胞/ml；

(t3)细胞活率≥90％；和

(t4)总的培养时间≥72小时；

其中，所述的转染操作包括：将用于生产所述慢病毒的生产质粒与转染试剂混合后，加入所述培养容器，从而导入所述的包装细胞，形成经转染的包装细胞；

(g)任选地进行转染后换液；

(h)对经转染的包装细胞进行培养，其中，培养的条件设定为在温度为30～37℃，溶氧为35～55％，CO₂浓度为2～10％和pH 6.9-7.4下进行，并且在所述传代培养过程中，监控所述第一培养物的实时pH值，并基于所述实时pH值对溶氧和/或CO₂浓度进行控制，从而维持pH在6.9-7.4之间；

(i)当满足换液触发条件时，启动收获与换液操作，

其中，所述的换液触发条件包括：

(s1)实时pH≤6.9，较佳地≤7.0，较佳地≤7.05；

(s2)通过调控氧气、空气、氮气和/或CO₂浓度，实时pH值仍下降；和

(s3)传代培养时间≥72小时；

其中，所述换液操作包括：将位于所述培养物的无细胞的含病毒的料液进行回收，其中回收料液前所述培养物的体积为Vq2，而回收清液后所述培养物的体积为Vh2，则Vq2/Vh2之比为3-15(较佳地4-7，更佳地5-6)；

(j)重复步骤(h)和(i)m次，m为1、2、或3次，其中在重复之前，向所述培养容器中补加培养液，形成转染细胞培养物；

(k)将各次回收的回收液进行合并，获得经合并的含病毒的清液；和

(l)对所述的经合并的含病毒的清液进行纯化处理，从而得到经纯化的慢病毒载体；

其中，在上述所有步骤中采用的培养液均为无血清的细胞培养液。

2.如权利要求1所述的方法，所述的步骤(c)和/或(h)中，在摇动条件下进行培养。

3.如权利要求1所述的方法，在步骤(c)和/或(h)中，将pH维持在7.0-7.35之间。

4.如权利要求1所述的方法，在步骤(d)和/或(i)中，将Vq1/Vh1之比为5－10。