[发明专利]利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法

说明书

本发明公开了利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，首先无菌制备猪脾脏淋巴细胞悬液，加入SRBC及完全培养基放置37℃培养进行致敏，一定时间后再加入SRBC和补体，放置37℃孵育，取上清放置酶标仪测定OD值，然后通过公式计算法氏囊素活力。本发明方法具有灵敏、稳定、客观等优点，并且操作简便，周期短，成本低。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法

背景技术

法氏囊素是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊中分离出来的一种活性物质。有研究表明，鸡法氏囊素能有效促进禽类和哺乳类B淋巴细胞前体的分化和增殖，使机体快速产生免疫应答并促进抗体的分泌产生，提高机体的体液免疫水平。目前检测鸡法氏囊素效力的试验方法较少，且大部分检测方法是将鸡法氏囊素与疫苗联合使用，通过测定疫苗的抗体效价来体现鸡法氏囊素的效力。因此，这些检测方法具有局限性，且由于生物个体差异，容易导致试验的不稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，包括以下步骤：

1)取细胞培养板，分为空白组、对照组和试验组，每组设置若干个平行孔，具体如下：

空白组每孔加入250体积份猪脾脏淋巴细胞悬液和250体积份生理盐水；

对照组每孔加入250体积份猪脾脏淋巴细胞悬液、242.5体积份生理盐水和7.5体积份5～10％SRBC悬液；

试验组每孔加入250体积份猪脾脏淋巴细胞悬液、242.5体积份鸡法氏囊素溶液和7.5体积份5～10％SRBC悬液；

将各组细胞培养72～84h；

2)每组各孔分别加入500体积份0.18-0.22％致敏SRBC悬液，继续培养1～2h后，1500～2500r/min离心5～10min，各孔取500体积份上清液放置于另一细胞培养板中，采用酶标仪测定各孔上清液在415nm波长处的吸光度，记为OD_415nm；

3)鸡法氏囊素活力A＝(试验组OD_415nm均值-对照组OD_415nm均值)/对照组OD_415nm均值)×100％。

进一步，对照组OD_415nm均值/空白组OD_415nm均值应不低于1.1，试验结果有效。

步骤2)中，所述0.18～0.22％致敏SRBC悬液的制备方法为：将用生理盐水溶解后的补体和积压SRBC按10：1的比例混合，于0-4℃静置20-30min后，加入生理盐水配成0.18-0.22％的致敏SRBC悬液。

进一步，所述积压SRBC的制备方法为：将绵羊静脉血加入等量的阿氏液中，用Hank’s液洗涤细胞，1000-2000r/min离心10-20min，弃去上清液，洗涤3-4次，然后加入Hank’s液重悬沉淀细胞，1500-2500r/min离心10-20min，弃去上清液，沉淀细胞即为积压SRBC细胞。

步骤1)中，试验组加入的鸡法氏囊素溶液中的多肽浓度为0.25～1.0mg/ml。

步骤1)和步骤2)中，细胞培养条件为在37℃、5％CO₂条件下培养。

步骤1)中，所述SRBC悬液的浓度为10％；步骤2)中，所述致敏SRBC悬液的浓度为0.2％。