[发明专利]利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法

权利要求书

1.利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1) 取细胞培养板，分为空白组、对照组和试验组，每组设置若干个平行孔，具体如下：

空白组每孔加入250 体积份猪脾脏淋巴细胞悬液和250体积份生理盐水；

对照组每孔加入250 体积份猪脾脏淋巴细胞悬液、242.5 体积份生理盐水和7.5 体积份5~10% SRBC悬液；

试验组每孔加入250 体积份猪脾脏淋巴细胞悬液、242.5 体积份鸡法氏囊素溶液和7.5 体积份5~10% SRBC悬液；

将各组细胞培养72~84 h；

2）每组各孔分别加入500 体积份 0.18~0.22% 致敏SRBC悬液，继续培养1~2 h后，1500~2500 r/min离心5~10 min，各孔取500 体积份上清液放置于另一细胞培养板中，采用酶标仪测定各孔上清液在415 nm波长处的吸光度，记为OD415nm ；

3）鸡法氏囊素活力A=（试验组OD_415nm 均值-对照组OD_415nm均值）/对照组OD_415nm均值）×100%。

2.根据权利要求1所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：对照组OD_415nm均值/空白组OD_415nm均值≥1.1。

3. 根据权利要求1所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：步骤2）中，所述0.18~0.22% 致敏SRBC悬液的制备方法为：将用生理盐水溶解后的补体和积压SRBC按10：1的比例混合，于0- 4℃静置20-30min后，加入生理盐水配成0.18-0.22% 的致敏SRBC悬液。

4. 根据权利要求3所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：所述积压SRBC的制备方法为：将绵羊静脉血加入等量的阿氏液中，用Hank’s液洗涤细胞，1000-2000r/min离心10-20 min，弃去上清液，洗涤3-4次，然后加入Hank’s液重悬沉淀细胞，1500-2500 r/min离心10 -20min，弃去上清液，沉淀细胞即为积压SRBC细胞。

5. 根据权利要求1所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：步骤1）中，试验组加入的鸡法氏囊素溶液中的多肽浓度为0.25~1.0 mg/ml。

6. 根据权利要求1所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于： 步骤1）和步骤2）中，细胞培养条件为在37℃、5% CO₂条件下培养。

7.根据权利要求1所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：步骤1）中，所述SRBC悬液的浓度为10%；步骤2）中，所述致敏SRBC悬液的浓度为0.2%。

8.根据权利要求1所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：步骤1）中，所述猪脾脏淋巴细胞悬液的浓度为1.0~2.0×10⁷个细胞/ml猪脾脏淋巴细胞悬液。

9.根据权利要求8所述的利用体外定量溶血分光光度法测定鸡法氏囊素效力的方法，其特征在于：步骤1）中，所述猪脾脏淋巴细胞悬液的制备方法如下：

A．取新鲜猪脾脏，置于75%的酒精中消毒后用PBS清洗数次，去除表面层组织后剪碎，加入Hank’s液研磨后过滤，用Hank’s液洗涤细胞，1000~2000 r/min离心3~5 min，弃去上清液，收集沉淀细胞并继续洗涤2~3次；

B．用适量Hank’s液重悬最后一次洗涤后收集的沉淀细胞，得到细胞悬液，将所述细胞悬液加入含有细胞分离液的离心管中，1500~2500 r/min离心15~30 min，吸取淋巴细胞并置于另一离心管中，往离心管中加入Hank’s液洗涤淋巴细胞，然后于1000~2000 r/min离心3~5 min，弃去上清液，收集沉淀细胞并继续洗涤2~3次；

C．用维持培养液重悬上述步骤最后收集的沉淀细胞并将细胞进行稀释，得到猪脾脏淋巴细胞悬液。