[发明专利]一种用于制备DNA Ladder的引物对、DNA片段及方法

说明书

本发明公开了一种用于制备DNA Ladder的引物对、DNA片段及方法。该引物对扩增获得的双链DNA片段5’端和3’端具有相同的一段序列，该双链DNA片段既能作为PCR反应的引物，又能作为模板。随着PCR循环数的增加，小片段的DNA片段在PCR体系中逐渐减少，而扩增得到的大片段则逐渐增加，控制PCR循环数即可获得分子量相差固定核苷酸数量大小的DNA Ladder。利用本发明中的DNA Ladder制备方法，可以在一次PCR反应中制备出片段浓度相对均一的DNALadder，该方法克服了单片段PCR扩增法所需劳动强度大、多片段PCR扩增法条件优化复杂等缺陷，能够快速地制备DNA Ladder。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于制备DNA Ladder的引物对、DNA片段及方法。

背景技术

DNA分子量标准(DNA Ladder或DNA Marker)是指一系列已知分子量的DNA混合物，因DNA分子量不同而引起电泳迁移率的不同，从而形成DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量，是分子生物学实验常用的试剂耗材之一。DNALadder的制备方法可以分为限制性内切酶酶切法和PCR扩增法两种方法。

限制性内切酶酶切法系利用限制性内切酶对天然的基因组DNA或人工构建的质粒DNA进行酶切，从而得到DNA Ladder。由于天然来源的基因组DNA往往存在以下缺点：(1)酶切产生的片段分子量跨度虽然较大，但条带大小分布不均匀，不能人工调控DNA Ladder的片段大小和浓度；(2)酶切所用的内切酶不是常用的种类，制备成本较高，这些不足限制了其在DNA Ladder中的应用。人工构建的质粒DNA则是一次性把预先设计的各种DNA片段插入到质粒中，随后将质粒转化大肠杆菌，对大肠杆菌进行发酵培养，再对质粒DNA进行分离纯化，最后用限制性内切酶酶切质粒DNA即可获得事先设计好的DNA Ladder。该方法的优势在于制备规模容易放大、电泳条带锐利、重复性好。但在制备小片段的DNA Ladder时，由于DNA片段越小，结合的DNA染料就越少，其条带的亮度弱，所以人工构建的质粒DNA通常不适用于制备小片段的DNA Ladder。目前，小片段DNA Ladder的制备主要以PCR扩增法为主。

PCR扩增法是基于PCR能够快速有效地扩增大量的目的片段，在制备小片段DNALadder时优势明显，PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增，利用这些方法已能制备出DL1000(100-1000bp)DNA Ladder。然而，单片段扩增法需要对每个片段进行PCR扩增，检测各片段的PCR扩增效率和浓度情况，再按照设计好的分子量及浓度进行稀释与混合。单片段扩增法通常需要分别扩增数十个PCR反应，浓度调配过程费时费力，实验重复性差。多片段扩增法指在PCR体系中引入数十对引物，以期通过一次PCR来获得数十个DNA片段，然而，由于每个片段的扩增效率和反应参数都会存在差异，循环数越多，PCR扩增效率上的差距就会越加显著，导致优化过程费时费力，重复性差。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于制备DNA Ladder的引物对、DNA片段及方法。利用本发明方法制备DNA Ladder克服了单片段PCR扩增法所需劳动强度大、多片段PCR扩增法条件优化复杂等缺陷，能够快速地制备DNA Ladder。

一种用于制备DNA Ladder的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括位于5’端的第一互补结合区和位于3’端的第一模板结合区，所述下游引物包括位于5’端的第二互补结合区和位于3’端的第二模板结合区，所述第一互补结合区序列和第二互补结合区序列反向互补。

第一模板结合区和第二模板结合区作为在PCR时引物与模板的结合区域，本发明对模板的序列本身没有特殊要求，因为作为DNA Ladder，只需要考虑分子量大小，即片段中含有的碱基数量，而对序列本身并没限定。