[发明专利]来源于无色杆菌属CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用，更具体地涉及一种在包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变为特征的突变青霉素G酰化酶及利用该突变青霉素G酰化酶的β‑内酰胺抗生素的制备(合成)方法。本发明中公开的具有特定突变形式的来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体，其特征为，对多种半合成β‑内酰胺抗生素具有高效率的多重合成性能。

技术领域

本发明涉及来源于无色杆菌属(Achromobacter sp.)CCM 4824的青霉素G酰化酶突变体及其应用，更具体地涉及一种在包含SEQ ID NO.1所示的α亚基和SEQ ID NO.2所示的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白质序列中，包含选自A65αV、A102αE、A106αT、D74βQ、R120βC、T176βS、Y180βS、T193βI、Y248βF、F254βY、T292βS、F343βY、E366βV及T485βS组合的群中的至少一种突变为特征的突变青霉素G酰化酶及利用该突变青霉素G酰化酶的β-内酰胺抗生素的制备(合成)方法。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是临床应用中最重要的一类抗菌化合物。已知β-内酰胺的抗菌机制通过作用于催化细菌细胞壁材料即肽聚糖(peptidoglycan)合成的转肽酶(transpeptidase)和D-丙氨酸羧肽酶(D-alanine carboxypeptidase)，抑制肽聚糖(peptidoglycan)的合成，从而抑制微生物的生长。

然而，青霉素、头孢菌素等天然β-内酰胺类抗生素存在杀菌谱较窄，酸稳定性低和耐受性增加等问题，这促使半合成青霉素(SSP)、半合成头孢菌素(SSC)等半合成抗生素(SSA)被开发使用。

β-内酰胺抗生素已通过传统的化学方法投入工业化生产。通常，半合成β-内酰胺抗生素的化学合成在低温下使用活性中间体和有机溶剂的严格条件下进行，这导致下游工艺成本高以及工艺对环境有害。也就是说，它存在各种缺点，例如在化学工艺中使用有机溶剂或因合成温度非常低而需要大量的能量等。根据最近的环境法规，正在努力用酶促转化工艺代替传统化学工艺，以更可持续地生产(半)合成β-内酰胺抗生素。与常规化学方法相比，酶的使用具有几个优点：(1)避免使用有毒试剂或溶剂；(2)由于酶的特异性，不需要保护抗生素核的羧基；(3)在很大程度上可以避免包括外消旋化的副反应(side reaction)。

已发现青霉素G酰化酶(PenG酰化酶)可用于合成半合成β-内酰胺抗生素。在该过程中，PenG酰化酶促进活化的侧链和脱酰化形式的β-内酰胺中间体(例如6-APA、7-ADCA、7-ACA等)的缩合。酶催化的β-内酰胺抗生素合成可以在平衡控制或动力学控制的转化过程中进行。在平衡控制的转化条件下，可以达到的产物积累水平取决于反应的热力学平衡，当合成半合成抗生素时，特别是当反应在含水介质中进行时，这是不利的。在动力学控制的转化中，酶促进酰基从活化的侧链即酰基供体转移到β-内酰胺核即亲核受体。在制备半合成β-内酰胺抗生素时，活化的侧链可以是芳族羧酸的酰胺衍生物或甲酯。在这种情况下，产物积累水平取决于酶的催化性，并且可以瞬时实现酰基转移产物较高的非平衡浓度。

充当酰基转移酶的PenG酰化酶不仅把用作酰基供体的底物化合物(活化的侧链化合物)分解为游离化合物形式，而且还促进合成β-内酰胺抗生素的水解反应。该水解反应导致活化的侧链消失，这降低了酰基转移反应的效率。合成速率(S)与水解速率(H)之比是评价PenG酰化酶合成性能的重要参数。S/H比等于在酶促酰化反应过程中指定的条件下合成产物与水解产物的摩尔比。在此，合成产物被定义为由活化侧链和β-内酰胺核产生的β-内酰胺抗生素。其中水解产物被定义为与活化侧链对应的酸(游离侧链)。