[发明专利]柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法

说明书

本发明公开了一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：步骤一、取茎粗1mm以上和株高5‑10cm的柑橘幼苗植株，之后截取其上的节间茎段，然后将节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1‑3h，诱变处理液包含浓度0.5‑2mmol/L的叠氮化钠；步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行组织培养，至节间茎段的截面伤口处生长出再生芽；步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并对发生变异的再生芽进行生根培养，进而获得完整的柑橘突变体植株。本发明明确了叠氮化钠诱变柑橘幼年态节间茎段可产生稳定变异植株。本发明的处理方法致变效率大于10％、诱变效果显著，操作简便。

技术领域

本发明属于创制柑橘变异技术领域，特别涉及一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法。

背景技术

叠氮化钠是一种无残毒、使用相对安全的化学诱变剂。利用叠氮化钠处理纽荷尔脐橙枝条后，在枝条的一些叶腋处生发出的新梢上具有形态变异的叶片，并且利用分子标记能检测出变异叶片与对照叶片在基因组构成上存在差异，这些结果说明叠氮化钠对柑橘细胞的遗传物质具有致变效应。由于柑橘类果树的童期较长(一般5年以上)，因此利用叠氮化钠处理柑橘种子(致使生殖细胞的遗传物质变异，再经过有性生殖形成稳定遗传)从其后代中获得稳定突变体的工作周期需要很长的时间；此外，柑橘的腋芽已处于一定的分化状态，利用叠氮化钠直接处理柑橘腋芽(接穗)，经常仅造成腋芽各分生组织细胞中少数细胞发生突变，该类突变具有不稳定的特点，即很多变异叶片叶腋处再萌发的新梢叶片又恢复到正常状态，因此亦难于获得变异性状稳定的突变体。因此，如何能够利用较短的时间获得变异性状稳定的柑橘突变体是目前正在探索的一个难题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法。

进行单一细胞诱变再组培形成完整植株能避免嵌合突变体的产生。且，令本发明申请人感兴趣的是，柑橘节间茎段横截面伤口处的形成层细胞在一定条件下能分化发育成再生芽，且柑橘节间茎段易于获得，特别是柑橘幼年态节间茎段的再生效率很高，并且再生的芽可通过微芽嫁接和组培生根等方法形成完整的植株；至今，以柑橘实生苗胚轴和幼年态茎段作为外植体获得了90％以上的柑橘转基因植株，并且尚未见有嵌合体工程苗产生的报道。因此，申请人推断，柑橘节间茎段可作为柑橘单一体细胞的诱变试验材料，进一步地，可将其用于通过叠氮化钠化学诱变创制出稳定的柑橘突变体材料。目前，尚未发现叠氮化钠诱变柑橘幼年态节间茎段的相关研究报道，即利用叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段是否能产生稳定变异、叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段产生变异再生芽的处理条件等均未有研究报道。进一步地，若利用叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段能够产生稳定变异，如何简单有效利用叠氮化钠侵染柑橘幼年态节间茎段的处理方法亦未有任何研究报道。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：

步骤一、取茎粗1mm以上和株高5-10cm的柑橘幼苗植株，之后截取所述柑橘幼苗植株上的节间茎段，然后将该节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1-3h，该诱变处理液包含浓度0.5-2mmol/L的叠氮化钠；步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行组织培养，至该节间茎段的截面伤口处生长出再生芽；以及步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并培养该发生变异的再生芽生根，获得柑橘突变体植株。

优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，所述诱变处理液的配置方法为：称取适量的叠氮化钠加入pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，得到所述诱变处理液。

优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，所述诱变处理液包含浓度1mmol/L的叠氮化钠，进行诱变处理的时间为2h。