[发明专利]柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法

权利要求书

1.一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括如下步骤：

步骤一、取茎粗1mm以上和株高5-10cm的柑橘幼苗植株，之后截取所述柑橘幼苗植株上的节间茎段，然后将该节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1-3h，该诱变处理液由如下组分组成：浓度0.5-2mmol/L的叠氮化钠、终浓度为0.5％(v/v)SilwetL-77和pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液，将所述节间茎段浸泡于诱变处理液中时，首先将所述节间茎段包裹于纱布袋内，之后再将纱布袋浸泡于所述诱变处理液中，所述诱变处理液的配制方法为：称取适量的叠氮化钠加入pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，得到所述诱变处理液，所述诱变处理液在使用时，加入表面活性剂Silwet L-77，使其终浓度为0.5％(v/v)；

步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行组织培养，至该节间茎段的截面伤口处生长出再生芽；以及

步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并培养该发生变异的再生芽生根，获得完整的柑橘突变体植株，其中，获得完整的柑橘突变体植株的具体方法包括：

取一直径9cm的滤纸放置于液体生根培养基的表面，将发生变异的再生芽放置于所述滤纸上，每张滤纸放置3-7个再生芽，光照培养3-5天，其中，所述生根培养基包含：1/2MS盐，浓度10g/L的蔗糖，初始浓度1g/L的吲哚丁酸和初始浓度2g/L的萘乙酸；

然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为1.5g/L，萘乙酸的浓度为3g/L，继续光照培养5-6天；

再然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为2g/L，萘乙酸的浓度为4g/L，并向液体生根培养基中加入纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末，继续光照培养5-8天，获得生根的变异苗，将该变异苗继续培养，得到完整植株，其中，所述纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末与所述液体生根培养基的质量比依次为1:4、1:4、1:10和1:20。

2.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，所述诱变处理液包含浓度1mmol/L的叠氮化钠，进行诱变处理的时间为2h。

3.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤二中，将经过诱变处理之后的节间茎段置于诱导培养基上进行光照培养，该诱导培养基包含：MS盐，浓度30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂粉和3g/L的6-苄氨基腺嘌呤，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m^-2s^-1，培养温度为26-28℃。

4.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，获得所述柑橘幼苗植株的方法包括：

取柑橘种子，用1％(w/v)的NaClO消毒，之后4℃放置过夜后，然后播种于MS盐固体培养基上，且播种后首先暗培养约20d，之后进行光照培养，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m^-2s^-1，培养温度为26-28℃，至得到所述柑橘幼苗植株。

5.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤三中，SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。

6.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，每个所述节间茎段长度1cm。