[发明专利]慢性青光眼动物模型建立方法及其应用

说明书

本发明公开的慢性青光眼动物模型建立方法，包括步骤：（1）取GFP‑SD大鼠的结膜组织，灭菌，消化，分离结膜上皮层，得到结膜基质组织块；（2）结膜基质组织块胰酶中消化，用细胞培养液终止消化，吹打成单细胞悬浊液，经细胞筛，离心处理，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；（3）加入适量的细胞培养液，吹打成单细胞后进行计数，体外培养，得到数量可观的结膜基质细胞；（4）结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤（2）的方法处理得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液得到细胞悬浊液；（5）将10 ul 细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀。该方法得到的青光眼动物模型具有长期稳定、简便易行、重复性好、成本低的优点。

技术领域

本发明涉及一种慢性青光眼动物模型建立方法及其应用。

背景技术

青光眼是以视神经萎缩、视野缺损及视力下降为共同特征的一组疾病，病理性眼压增高、视神经供血不足是其发病的原发危险因素，视神经对压力损害的耐受性也与青光眼的发生和发展有关。截至2010年，全球约有3千万青光眼患者，40岁以上人群患病率为3.5%（[1] Glaucoma(2017).The Lancet.2017;390:2183-2193）。青光眼是全球三大致盲疾病之一，严重影响人民的生活质量。

青光眼动物模型对于更好的理解青光眼性视神经病变的损伤机制及治疗措施有着重要的作用。目前慢性青光眼的动物模型主要有眼巩膜表面房水静脉注射高渗盐水法、激光诱导法、巩膜上静脉烧灼法、前方注射聚苯乙烯微球等方法（[2]Rodent models ofglaucoma(2010).Brain Research Bulletin.2010;81:349-358）。虽然这些方法在建模初期均能使得实验动物眼内压的增高，但这些慢性青光眼动物模型的建立大多需要较高的技术条件，甚至维持动物高眼内压的时间相对比较短暂。

有鉴于此，本发明人深入青光眼模型的研究工作，提出一种持续时间长、成本更低的慢性青光眼模型的建立方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种长期稳定、简便易行、重复性好、成本低的慢性青光眼动物模型建立方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

慢性青光眼动物模型建立方法，包括以下步骤：

（1）取GFP-SD大鼠的结膜组织，灭菌；将结膜组织放入分散酶或IV型胶原酶消化液中，并置于细胞培养箱消化，分离弃掉结膜上皮层，得到结膜基质组织块；

（2）将前述结膜基质组织块放入胰酶中消化，用细胞培养液终止消化，并吹打成单细胞悬浊液；单细胞悬浊液经70um孔径大小的细胞筛后于离心机中离心处理，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；

（3）在前述结膜基质细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，吹打成单细胞后进行计数，将单细胞以一定密度种植于培养皿中进行体外培养，得到数量可观的结膜基质细胞；

（4）经步骤（3）体外培养得到的结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤（2）的方法处理得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液得到细胞悬浊液，细胞计数，使得最终细胞密度为1 × 10⁷ 个/ml；

（5）在麻醉下将10 ul 步骤（4）得到的细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀，使其均匀分布于前房，左眼不处理作为正常对照眼球。

优选的，所述结膜组织需用灭菌PBS洗2遍。

优选的，所述结膜组织的消化条件为：放入中性蛋白酶或IV型胶原酶消化液中并置于37°C细胞培养箱中消化2小时或4°C过夜。

优选的，步骤（2）中，结膜基质组织块放入胰酶中消化时间为10 min。

优选的，所述离心处理的条件为：4°C离心机中1500rpm离心5min。