[发明专利]慢性青光眼动物模型建立方法及其应用

权利要求书

1.慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取GFP-SD大鼠的结膜组织，灭菌；将结膜组织放入分散酶或IV型胶原酶消化液中，并置于细胞培养箱消化，分离弃掉结膜上皮层，得到结膜基质组织块；

（2）将前述结膜基质组织块放入胰酶中消化，用细胞培养液终止消化，并吹打成单细胞悬浊液；单细胞悬浊液经70um孔径大小的细胞筛，后于离心机中离心处理，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；

（3）在前述结膜基质细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，吹打成单细胞后进行计数，将单细胞以一定密度种植于培养皿中进行体外培养，得到数量可观的结膜基质细胞；

（4）经体外培养得到的结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤（2）的方法处理得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液得到细胞悬浊液，细胞计数，使得最终细胞密度为1 ×10⁷ 个/ml；

（5）在麻醉下将10 ul 步骤（4）得到的细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀，使其均匀分布于前房，左眼不处理作为正常对照眼球。

2.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：步骤（1）中，所述结膜组织需用灭菌PBS洗2遍。

3.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：所述结膜组织的消化条件为：放入中性蛋白酶或IV型胶原酶消化液中并置于37°C细胞培养箱中消化2小时或4°C过夜。

4.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：步骤（2）中，结膜基质组织块放入胰酶中消化时间为10 min。

5.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：所述离心处理的条件为：4°C离心机中1500rpm离心5min。

6.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：步骤（2）和（3）的细胞培养液均采用含10% FBS、1% 链霉素、1% 青霉素的DMEM培养液。

7.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：所述体外培养包括：以3-5× 10⁵ 个/ml种植于直径为100mm的培养皿中，每隔一天换液一次，待细胞长满后传代培养。

8.如权利要求1-8任一项权利要求所述的慢性青光眼动物模型建立方法在慢性青光眼的模拟和防治中的应用。