[发明专利]一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种S‑poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，包括如下步骤：初筛阶段：将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份进行筛选，利用S‑poly(T)PCR技术，对已知血液中表达的485miRNA进行检测，分析筛选出存在显著性异常表达的miRNA；复筛阶段：将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期，将结直肠癌I‑II期33例、结直肠癌III‑IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份，利用S‑poly(T)PCR技术，对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测，选出备选miRNA用于单个验证；验证阶段：对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证，分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性，评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力，本发明，检测方法，简单，实用。

技术领域

本发明涉及医疗检测技术领域，具体为一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法。

背景技术

结直肠癌在我国的发病率高居肿瘤排行榜第五位，其死亡率也一直居高不下，已成为威胁我国公众健康及生命的主要疾病之一，且目前有统计表明，近年来结直肠癌的发病率仍呈逐步升高的趋势，其早、晚期五年生存率存在巨大差距，转移性结直肠癌的五年生存率不足13％，而早期结直肠癌五年生存率可达90％以上，但由于缺乏有效的早期诊断指标和手段，其早期诊断率仍不足结直肠癌诊断的40％，大多数结直肠癌患者入院时已是晚期，错过了最佳治疗的黄金时期。

目前结直肠癌的诊断主要依靠结肠镜检查及活体组织病理检查，但由于其花费高并伴随一定的检查痛苦与风险以及由于检查医师技术问题，如肠道准备不全、退镜速度过快等，存在一定漏诊率，难以达到普查要求。CT、MRI等影像学检查由于对结直肠微小病变难以做到早期诊断，并不足以满足临床要求。目前临床常用的粪便隐血试验及肿瘤标志物如CEA等，由于敏感性和特异性不足，不能有效的对结直肠癌进行筛查与早期诊断。寻找一种可用于结直肠癌早期诊断的花费低、创伤小的新型肿瘤标志物已成为一大热点。越来越多研究证明miRNA与肿瘤的发生发展及预后等存在密切关系，有望成为临床肿瘤的一种新型标志物。

所以，如何设计一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，成为我们当前要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，包括如下步骤：

1)初筛阶段：将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份进行筛选，利用S-poly(T)PCR技术，对已知血液中表达的485miRNA进行检测，分析筛选出存在显著性异常表达的miRNA；

2)复筛阶段：将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期，将结直肠癌I-II期33例、结直肠癌III-IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份，利用S-poly(T)PCR技术，对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测，选出备选miRNA用于单个验证；

3)验证阶段：对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证，分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性，评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力。

根据上述技术方案，所述初筛阶段对本院收集的53例结直肠癌、87例健康人分别做血浆混合样本，利用S-poly(T)PCR技术检测485个miRNA，按照以下标准：FC(foldchange)>1或FC<-1、p<0.05，单个样本Ct值<35，筛选出显著差异的16种miRNA，其中2种miRNA上调，14种miRNA下调。