[发明专利]一种包含阿片受体基因的检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，其特征在于：包含两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物及两个甲基化特异性测序引物，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关；同时，所述两对阿片受体基因OPRM1和OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物均包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。

2.如权利要求1所述的一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，其特征在于：所述阿片受体基因OPRM1启动子区甲基化特异性扩增引物包括以下核苷酸序列：

所述OPRM1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：

5'-biotin-TAGTTAGGATTGGTTTTTGTAAGAAATAG-3'；

所述OPRM1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：

5'-ATACCCCAAAACATCAATACAATTACTAAC-3'；

所述OPRM1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：

5'-CTATACCAAATAACCAAAAACAC-3'。

3.如权利要求1所述的一种包含阿片受体基因的检测试剂盒，其特征在于：所述阿片受体基因OPRL1启动子区甲基化特异性扩增引物包括以下核苷酸序列：

所述OPRL1甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：

5'-biotin-GTTTGTTTAGTTTGGGAAAGAGG-3'；

所述OPRL1甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：

5'-ACACAAAAATCTCCCCCTTC-3'；

所述OPRL1甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：

5'-ACCCCCCACAACACA-3'。

4.利用权利要求1所述的包含阿片受体基因的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括下述步骤：

步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；

步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对所述OPRM1、OPRL1基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

步骤四：将步骤三中得到的PCR扩增产物中加入至包含退火缓冲液的PSQ96板中并充分反应，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，使用真空准备工具吸附磁珠后，再将放有PCR扩增产物的PSQ96板加热至80℃并冷却至室温后，进行焦磷酸测序。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤三中的PCR扩增条件为：首先在温度95℃加热10min至变性，然后重复30-50个退火反应，所述退火反应的条件为在温度95℃加热30s，复性40s，在温度72℃下延伸50s；最后在温度72℃延伸7min。