[发明专利]一种利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌

说明书

本发明公开了一种利用天然双碳源高产N‑乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。本发明通过强启动子P₄₃过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因PckA，利用葡萄糖、L‑苹果酸钠天然双碳源发酵，实现N‑乙酰神经氨酸合成途径中磷酸烯醇式丙酮酸的高效供给，以加强合成途径，本发明的重组枯草芽孢杆菌与出发菌株相比，其N‑乙酰神经氨酸产量从1.15g/L提高到1.65g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N‑乙酰神经氨酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是生物体内重要的糖类物质，在生物体内负责信号传递等功能。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞间信号转导、识别等重要生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于流感抗炎，增强免疫力，促进适龄婴儿大脑发育，以及维持老年人大脑功能和健康。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从蛋类、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品易引起过敏反应，或是通过化学法合成，高温、高压工艺复杂，且对环境污染严重，或是大肠杆菌全细胞催化反应获得，存在底物转化率低，产物不易分离等问题。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，通过基因工程改造枯草芽孢杆菌，可以高效生产食品安全级N-乙酰神经氨酸。然而，枯草芽孢杆菌自身合成途径代谢流通量不足，影响N-乙酰神经氨酸合成效率。如何强化枯草芽孢杆菌代谢流供给，实现N-乙酰神经氨酸合成前体的高效供给，对于N-乙酰神经氨酸的工业化生产具有重要意义。

发明内容

有报道表明，当底物存在葡萄糖的情况下，枯草芽孢杆菌可以同时、高效利用L-苹果酸钠，且L-苹果酸钠代谢主要流向Neu5Ac合成前体之一的磷酸烯醇式丙酮酸(Chubukov,V.et al.Transcriptional regulation is insufficient to explain substrate‐induced flux changes in Bacillus subtilis.Molecular systems biology 9,709(2013).)，据此，本发明利用枯草芽孢杆菌利用葡萄糖和L-苹果酸钠天然双碳源的特性，进一步以强启动子P₄₃过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA，强化L-苹果酸钠向磷酸烯醇式丙酮酸代谢流，以提高Neu5Ac合成效率。

本发明的第一个目的是提供一种高效利用天然双碳源生产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，所述天然双碳源为葡萄糖和L-苹果酸。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组中以组成型强启动子P₄₃过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB为宿主构建得到的。