[发明专利]一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用

说明书

本发明涉及脂肪干细胞膜片，特别是一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用。属于组织工程与再生医学领域。该方法包括如下步骤：步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。本发明利用细胞膜片培养基添加外源性因素(TGF‑β1，EGF，PDGF‑BB，17‑β雌二醇)复合子宫内膜细胞共培养，诱导人脂肪干细胞成膜，这个膜片培养体系，诱导成的膜片各上皮标记mRNA表达量上调，免疫荧光显示蛋白CK18表达阳性，提示部分干细胞向上皮细胞转化。这个体系诱导出的膜片在修复子宫内膜上皮方面更有效。

技术领域

本发明涉及脂肪干细胞膜片，特别是一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用。属于组织工程与再生医学领域。

背景技术

正常的子宫内膜分为基底层和功能层，功能层在雌孕激素的作用下发生周期性脱落，脱落后由基底层再生，如果基底层损伤，则子宫内膜功能层无法再生，胶原大量沉积，出现不可逆性瘢痕修复，造成宫腔粘连。

90％的宫腔粘连的发生与妊娠或者非妊娠时子宫遭受机械性损伤有关，其中与妊娠相关的清宫术是导致宫腔粘连的主因，世界卫生组织(WHO)统计，全球每年有4000万妇女进行人工流产，中国每年人工流产达1400万人次，排世界第一位宫腔粘连已经成为继发性不孕患者的最常见原因，占继发性不孕症发病原因的8％，它还可导致习惯性流产，试管婴儿植入失败等并发症，严重威胁我国育龄期妇女的生殖健康。

目前临床上治疗宫腔粘连的主要方法为宫腔镜下粘连松解术，术后放置宫内节育器等。但各种预防措施的效果均不尽如人意，治疗后粘连再形成的发生率在所有患者中约为3.1％～23.5％，重度患者中可达20％～62.5％。如果子宫内膜损伤面积过大或完全裸露，即使手术恢复了宫腔形态，内膜也很难再生，恢复功能。为了解决这一难题，生殖专家把目标转移到了目前的研究热点组织工程技术上,自从1993年细胞膜片技术发明以来，从最初昂贵的温度敏感培养基，发展到现在仅在完全培养基中加入活性因子即可诱导细胞重叠生长，从而获得由细胞、细胞外基质构成,为克服上述缺点带来希望。但是如何能有效防止子宫损伤后形成的宫腔粘连，能使细胞膜片具有促进组织再生机制，从而促进子宫内膜伤口愈合的功效目前还没有定论需要进一步研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用，本发明这种方法是一种新的培养体系用于诱导人的脂肪干细胞形成脂肪干细胞膜片，这种方式诱导形成的膜片不仅含有大量的细胞外基质，同时诱导部分干细胞转化为上皮细胞，更利于修复人子宫内膜上皮组织。

本发明的技术方案是：一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；

步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；

步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。

所述步骤1)脂肪干细胞：取脂肪组织20ml，用PBS清洗，眼科剪剪碎后加20ml的0.25％的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min；加入等量的含10％胎牛血清的ɑ-mem完全培养基终止消化，1000转5min离心，去上清，加10ml含10％胎牛血清的ɑ-mem完全培养基重悬接种在75cm²培养瓶中，48h后换液，脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80％-90％时胰酶消化传代。