[发明专利]一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用

权利要求书

1.一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

步骤1）选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；

步骤2）将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；

步骤3）采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片；具体步骤为：将步骤1）的脂肪干细胞按照1×10⁴/cm²密度接种在六孔板中，步骤1）的培养基更换为诱导培养基；孔板中放置transwell小室，小室滤膜孔径为0.8um，小室内按3×10³个接种步骤2）子宫内膜细胞，每两天更换诱导培养基，连续培养两周，膜片形成；

所述子宫内膜细胞包括子宫内膜基质细胞和子宫内膜上皮细胞；所述化学诱导的诱导培养基由膜片培养基和上皮细胞诱导剂组成，其中，膜片培养基为gibco的ɑ-MEM培养基添加10%的FBS和100um/ml维生素C；上皮细胞诱导剂为1×10^-7 mol/L β-雌二醇、10 ng/mlTGF-β1、 10 ng/ml EGF和10 ng/ml PDGF-BB。

2.根据权利要求1所述的一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：所述步骤1）脂肪干细胞：取脂肪组织20ml，用PBS清洗，眼科剪剪碎后加20ml的0.25%的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min；加入等量的含10%胎牛血清的ɑ-MEM完全培养基终止消化，1000r/min离心5min，去上清，加10ml含10%胎牛血清的ɑ-MEM完全培养基重悬接种在75cm²培养瓶中，48h后换液，脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80%-90%时胰酶消化传代。

3.根据权利要求1所述的一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：所述步骤2）子宫内膜细胞：取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗，眼科剪剪去血污组织后，剪碎，加入20ml的0.25%Ι型胶原酶，37℃恒温摇床消化120 min，加入等体积的含10%胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化，用100目的筛网过滤，将滤液再次使用200目的筛网过滤，收集滤液1000r/min离心10min，弃上清，放入α-MEM完全培养液重悬，1000r/min，再次离心10min，弃上清，α-MEM完全培养液重悬，接种于6孔板中，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养，24 h后换液，洗去悬浮细胞碎片和杂质，得子宫内膜细胞。

4.一种权利要求1所述的构建脂肪干细胞膜片的方法构建的脂肪干细胞膜片在制备子宫内膜上皮组织修复材料中的应用。