[发明专利]一株高产乙偶姻细菌的选育与生产

说明书

本发明公开了一种高产乙偶姻细菌的选育与生产。属于生物工程技术领域。本发明菌株是将校园果树下土样稀释涂布，通过VP实验进行筛选并进行形态和生理生化鉴定，利用分光光度法筛选到一株高产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌。本发明同时公开了一种利用该菌株生产乙偶姻的方法，利用该方法生产乙偶姻，其产量达到42g/L。

技术领域

一株高产乙偶姻细菌的选育与生产，属于生物工程领域。

背景技术

乙偶姻又称为3-羟基-2-丁酮(acetoin)，具有明显的脂香特征，是一种被大众广泛使用的食用香料，经常添加到奶油、乳品、酸奶的制作中，并作为干酪、咖啡、坚果的香味增强剂；在酿酒行业中，80%含量的乙偶姻俗称“醋嗡”，可作酒类调香中的重要品种；在制药行业，乙偶姻可用于药物的合成，如乙偶姻可用以合成医药中间体4-氯-4,5-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮（CDMDO）^[3]，从而提高药效，减轻药物的副作用；在烟草行业，乙偶姻、1-戊烯-3-醇等物质具有典型的香气特征，是特香型烤烟中特殊香气的主要物质^[4]；此外，在IT行业中，具有光学活性的乙偶姻衍生物可作为液晶材料的重要成分^[5]。同时，乙偶姻作为一种平台化合物广泛应用于其他行业，2004年，美国能源部将其定义为30种优先利用的平台化合物之一^[6]。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产乙偶姻菌株的筛选方法以及利益该菌株生产乙偶姻。

本发明的技术方案。

1、在高产乙偶姻细菌的筛选方法。

在果树下用小铲挖取表面约3cm厚的土壤，取土样大约50g，装入小烧杯保存。

富集培养：取10g土壤溶解于90mL无菌水中制成悬液，以此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-8，取10^-6、10^-7、10^-8的稀释菌悬液接种于LB液体培养基，在37℃、150r/min的摇床上培养12-24h。

菌株初筛：将富集得到的菌液梯度稀释至10^-8，取10^-6、10^-7、10^-8的稀释菌悬液涂布到筛选培养基上，在37℃培养箱中培养24h。观察培养基平板上长出的菌落，并依菌落外观做大致分类，挑取不同形态的菌落在筛选培养基上进行平板划线分离，直至得到单菌落为止。

菌株复筛：挑取单菌落于种子培养基中在37℃摇床上培养12h后行V-P实验，将阳性菌株接种到初始发酵培养基中，培养24h后用分光光度法于520nm处测定乙偶姻产量，其中编号LXF04菌株产量最高。

2、根据权利要求1所述的一种高产乙偶姻菌株的选育方法，所选菌株的鉴定方法如下。

（1）形态鉴定

菌落的形状、干湿、颜色、边缘、表面、透明度。用光学显微镜及电子显微镜观察细胞形状、大小、是否有芽孢、鞭毛等；

（2）生理生化鉴定

革兰氏染色实验，淀粉水解试验，需氧性试验，明胶液化试验，过氧化氢酶试验。

通过形态和生理生化鉴定确定该菌株为解淀粉芽胞杆菌，并命名为Bacillus amyloliquefaciens LXF04。

3、本发明公开一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用Bacillus amyloliquefaciens LXF04为出发菌株，采用种子培养和液体发酵生产乙偶姻。

（1）种子培养