[发明专利]环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与检测方法

说明书

一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与实时荧光PCR检测方法，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，血液或淋巴液提取的微量病原体基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对环形泰勒虫的Tams1为靶基因的特异性区域，设计2条特异性引物，解决了现有PCR检测技术低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、环形泰勒虫含量较低时容易漏检的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于环形泰勒虫精准检测，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与检测方法。

背景技术

环形泰勒虫是由璃眼蜱传播的一种牛羊寄生虫，由其引起的疾病称为泰勒虫病。环形泰勒虫主要寄生于牛羊的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞。璃眼蜱是一种二宿主蜱，它以期间传播的方式传播环形泰勒虫，即幼虫或若虫吸食了带虫的血液后，泰勒虫在蜱体内发育繁殖，当蜱的成虫吸血时，即可传播本病。病畜表现为高热稽留，迅速消瘦，严重贫血，淋巴结肿大，淋巴结穿刺后涂片镜检，可在淋巴细胞和巨噬细胞内发现环形泰勒虫裂殖体。牛羊感染环形泰勒虫后，由于虫体在单核巨噬系统细胞内的反复裂体生殖和虫体的毒素作用，病畜出现较为严重的临床症状和病理变化。环形泰勒虫的临床诊断主要的方法是直接镜检、血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)和常规PCR 检测等。直接镜检只能用于对发病动物的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难；血清学诊断也存在敏感性不高的问题。敏感性更高的方法，例如常规 PCR检测技术也是诊断环形泰勒虫最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点一低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性。SYBR Green I实时荧光 PCR使用一对特异性引物和SYBR Green I核酸染料，精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，产出率高。SYBR Green I结合到双链DNA后，荧光强度增加，荧光信号随PCR进程与不断生成的产物成正比，形成荧光扩增曲线；PCR反应结束后，进行熔解曲线分析，从60℃到95℃，每升高单位温度仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快，将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，证明反应特异性好。SYBR Green I实时荧光PCR引物设计简单，成本相对较低，适用于各种病原体基因水平的检测。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了了一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与实时荧光PCR检测方法，建立一种精准、高效、实用的DNA检测方法。以环形泰勒虫的Tams1为靶基因的特异性区域，设计2条特异性引物，提供了一种环形泰勒虫的SYBR Green I 实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与实时荧光PCR检测方法，可用于泰勒虫病精准检测，应用前景广阔，该方法可用于泰勒虫病流行病学调查及快速检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光 PCR特异性引物，以环形泰勒虫的Tams1为靶基因的特异性区域，包括设计的 2条特异性引物，具体为：

Tams-F：5′-CAA-ATT-CGA-GAC-CTA-CTA-CGA-TC-3＇；

Tams-R：5′-CCA-CTT-ATC-GTC-CTT-AAG-CTC-G-3＇。

一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR检测试剂盒，所述的实时荧光PCR检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的2条特异性引物Tams-F、Tams-R；

(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含环形泰勒虫1014bp基因片段；

(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；