[发明专利]环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR特异性引物及检测试剂盒与检测方法

权利要求书

1.一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR特异性引物，其特征在于，以环形泰勒虫的Tamsl为靶基因的特异性区域，设计的2条特异性引物，具体为：

Tams-F：5′-CAA-ATT-CGA-GAC-CTA-CTA-CGA-TC-3＇；

Tams-R：5′-CCA-CTT-ATC-GTC-CTT-AAG-CTC-G-3＇。

2.一种环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的实时荧光PCR检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的2条特异性引物Tams-F、Tams-R；

(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含环形泰勒虫1014bp基因片段；

(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

(四)含有Taq酶、dNTP、Mg²⁺和SYBR Green I的商品化SYBR预混液-Premix ExTaq^TMII(2x)；

(五)ROX Reference Dye II(50x)。

3.根据权利要求2所述的环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。

4.一种采用权利要求1所述的特异性引物的环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)被检标本DNA提取：取病牛的淋巴液，用商品化的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存备用。

(2)以权利要求1中的引物Tams-F和Tams-R扩增：在实时荧光PCR八连管中加入病牛淋巴液提取的DNA，同时设置阴、阳性对照，Premix Ex Taq^TMII(2x)，10μM Tams-F，10μM Tams-R，ROX Reference Dye II(50x)，DNA模板，ddH₂O于25μL反应体系中混匀后稍离心。

(3)测序：将实时荧光PCR产物送测序公司进行序列测定。

5.根据权利要求4所述的环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的实时荧光PCR反应条件为：

95℃预变性1min；

95℃保持10sec；60℃保持34sec；72℃保持30sec，该步骤进行共40个循环：

反应结束后先加热至95℃，再降至60℃，然后以每秒1％的速度递增至95℃

直至检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。

6.根据权利要求4所述的环形泰勒虫SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中SYBR Green I实时荧光PCR 25μL反应体系中，病牛淋巴液样品基因组DNA模板量为2μL，Premix Ex Taq^TM II(2x)为12.5μL，ROX Reference Dye II为0.5μL，10μM Tams-F为1μL，0μM Tams-R为1μL，ddH₂O为8μL。