[发明专利]鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物

说明书

本发明公开了一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物，包括针对鸭新城疫病毒的引物、针对鸭瘟病毒的引物和针对鸭坦布苏病毒的引物，各类引物的序列如下：针对鸭新城疫病毒的引物：NDV‑F：5’‑TCCCAGYACCYYTGACMCTG‑3’，NDV‑R：5’‑CTGCCACTGCTAGTTGTGATAAT‑3’；针对鸭瘟病毒的引物：DPV‑F：5’‑TAGCGCATACTCGTTCTCCA‑3’，DPV‑R：5’‑TTACACACAGCGGTTGCAAG‑3’；针对鸭坦布苏病毒的引物：DTMUV‑F：5’‑TACTTGAGGCCAAGAATACG‑3’，DTMUV‑R：5’‑TTTGCCGTGATGGTCACACA‑3’。本发明建立的多重PCR体系可准确检测水禽NDV、DPV、DTMUV的单一或混合感染，并对该多重PCR体系进行了优化，确定了最佳的引物比例、引物浓度和Premix rTaq酶，使得NDV、DPV、DTMUV3种病毒的DNA扩增效果更好，检测精度更高，在病毒鉴别领域具有重要优势。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物。

背景技术

鸭新城疫(Newcastle Disease，ND)是由鸭源新城疫病毒（NDV）引起的以消化道病变为主要特征、具有高度发病率和致死率的烈性传染病。传统理论认为新城疫病毒不感染水禽，即使感染也不发病，近年来新城疫病毒的致病力和宿主范围发生了变化，对鸭表现为高致病性，鸭群中流行的新城疫会给养鸭业造成较大损失。鸭瘟（Duck plague，DP）又称鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE），是由疱疹病毒科的鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、热性、败血性传染病。该病流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率均很高，严重威胁养鸭业的发展。ND和DP都有相同的临床症状，精神沉郁，两腿无力，呼吸困难，角弓反张，下痢，在临床上较难做出诊断。鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus disease，DTMUVD)是由鸭坦布苏病毒(DTMUV)引起的一种急性传染病。该病以高热、产蛋量骤降甚至停产和卵泡出血为主要特征，病程可长达数周。ND、DP、DTMUVD病与均能引起蛋鸭产蛋下降。

PCR全称为聚合酶链式反应，是目前应用广泛、简便、快速且特异性高的一种检测方法。PCR利用DNA高温变性、低温复性、适温延伸的特性，设计变性、退火、延伸为一个周期，不断循环复制DNA，使得到大量的PCR产物易于检测。多重PCR与常规PCR的原理相同，但在同一反应管加入多对引物，使之同时扩增出多条目的DNA片段。该法既克服了常规PCR一次只能检测一种病毒、检测结果易出现假阳性的不足，具有较高的灵敏度和特异性。目前检测鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病这3种病毒大多采用常规PCR方法，要做多次检测，不仅费时费力，还可能造成误诊。

另外，由于纳米粒子的特殊效应，纳米科学是当今世界投入最多发展最快的科技之一，目前纳米粒子可以用到许多方面。一些学者把寻找新型添加剂的目光投向了纳米粒子。例如中国发明专利申请CN107058619A公开了一种牛呼吸道合胞体病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBuffer Mix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒，该试剂盒灵敏度高；专利CN101134975A中使用的优化PCR扩增的纳米材料为纳米碳粉，与已有的PCR 扩增优化剂相比，纳米碳粉优化扩增的效果明显；专利CN101792787A公开了一种组合纳米材料优化PCR的方法，通过向扩增体系中加入胶体HAuCl₄和有机试剂，实现扩增目的基因的特异性，效果非常明显。但是金纳米颗粒溶胶的制造成本较高，较难大规模推广应用，纳米碳粉虽然成本较低，但是对扩增反应的优化有限，效果常常不够理想；另外，申请人通过大量试验发现，鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的cDNA或DNA具有一定的特异性，现有的金纳米颗粒溶胶和纳米碳粉对其扩增的优化效果不佳，不能满足扩增要求。

发明内容