[发明专利]鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物

权利要求书

1.一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，该试剂组合包括针对鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒的三对引物、Premix rTaq酶和Nd2O3-TiO2纳米颗粒；

所述三对引物的序列如下：

针对鸭新城疫病毒的引物：

NDV-F：5’ -TCCCAGYACCYYTGACMCTG -3’，

NDV-R：5’ - CTGCCACTGCTAGTTGTGATAAT -3’；

针对鸭瘟病毒的引物：

DPV-F：5’ - TAGCGCATACTCGTTCTCCA -3’，

DPV-R：5’ - TTACACACAGCGGTTGCAAG -3’；

针对鸭坦布苏病毒的引物：

DTMUV-F：5’ - TACTTGAGGCCAAGAATACG -3’，

DTMUV-R：5’ - TTTGCCGTGATGGTCACACA -3’。

2.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述检测试剂组合用于检测水禽NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。

3.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述检测试剂组合总体积为20μL，其中：所述Premix rTaq酶10μL；所述针对鸭新城疫病毒的引物0 .5μL，NDV-F和NDV-R各0 .25μL；针对鸭瘟病毒的引物3μL，DPV-F和DPV-R各1 .5μL；针对鸭坦布苏病毒的引物2μL，DTMUV-F和DTMUV-R各1μL；DNA模板3μL；加灭菌水至总体积为20 μL；所述PremixrTaq酶中溶质的浓度为10μmoL/L。

4.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的含量≤1 .52μmol/L，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的制备方法为：

1) 将TiO2粉末浸泡在溶质质量分数为5%～10%的Nd(NO3)3溶液中，对溶液进行超声波分散10min以上；

2) 将步骤1)中的溶液过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相400℃煅烧10min，煅烧后的固相自然冷却至室温，再浸泡在步骤1)所述的Nd (NO3)3溶液中，超声波分散10min以上；

3) 浸泡完成后过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相于400℃煅烧1h，煅烧后自然冷却，即获得Nd2O3-TiO2颗粒；

4) 将所述Nd2O3-TiO2颗粒进行球磨，球磨后过10000目以上的筛网，收集过筛粉末，即为Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入多重PCR检测试剂组合前，先做表面处理，处理步骤为：

(1) 配制处理液：所述处理液为浓度为0 .03～0 .06mol/L的硝酸溶液；

(2) 表面处理：将所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入所述硝酸溶液中，对溶液充分搅拌，搅拌过程中向溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的浓度为0 .01～0 .02mol/L；

(3) 柠檬酸充分溶解后，再对溶液搅拌5～10min，搅拌完成后固液分离，固相用去离子水洗净烘干，即获得表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

6.一种利用如权利要求1～5任一项所述的多重PCR检测试剂组合进行的不以疾病诊断治疗为目的的病毒检测方法，其特征在于，步骤包括：

1) 提取待检测临床样品组织中的病毒DNA和RNA；

2) 将所述RNA反转录为cDNA；

3) 利用所述多重PCR反应体系对所述病毒DNA和cDNA进行扩增；

4) 判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。