[发明专利]3D大脑类器官的制备方法

说明书

本发明提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次Matrigel包裹神经球后继续培养。本发明还提供了一种用于培养3D大脑类器官的培养基。本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，用较为简单的方法可以控制并培养得到大小及结构均一的真正的3D大脑类器官，其具有大脑的六层皮层结构和抑制性中间神经细胞各亚型，适用于体外疾病研究、药物筛选等，具有重大的产业化的意义。

技术领域

本发明属于3D大脑类器官技术领域，尤其涉及一种从人神经球制备3D大脑类器官的方法。

背景技术

人的神经细胞或大脑组织很难获得，在体外几乎无法培养，使得很多神经疾病的研究和药物研发没有很好的人源模型而停滞不前。由胚胎干细胞或诱导多能干细胞诱导分化得到人的神经细胞作为神经疾病模型是这几年国际上的创新技术和热点。同时由于3D培养更能模拟大脑组织环境和细胞交流，对于神经细胞的成熟和功能有着重要的促进作用，并且所得到3D大脑类器官在研究人大脑发育和相关疾病上有不可替代的作用，最近各种人3D器官的体外培养成为新的热点。

传统的人3D大脑类器官的制作方法一般通过从拟胚胎体(Embryonic Body)开始，如2013年及2014年Lancaster等发表在Nature及Nature protocol上的3D大脑类器官的制作方法使得界内在体外使用人多能干细胞(包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞)得到3D的模拟人大脑的类器官上前进了一大步。最近Qian等2016年在Cell上发表的也是使用类似的方法从人多能干细胞制作大脑类器官来研究寨卡病毒引发小脑症的机制，并且发明了小的多孔板搅拌装置来降低因子的用量和成本，以及增加均一性。但是，这两种方法所得到的3D大脑类器官由于同时可能含有其他胚层的细胞和结构，难以稳定控制得到产品的可重复性，结构相似性等，在神经系统疾病模型和药物筛选领域的应用受到限制，同时也影响到用其所获得数据的代表性和可靠性。

2017年Lee等在Neuropsychopharmacology上发表的文章中，其手工挑选出大小在50000～200000微米之间的玫瑰花样细胞簇(主要为NPC，神经前体细胞)，对其进行诱导，但是其得到的3D新大脑皮层小体不具有发育出后脑 (NKX2.1染色为阴性)的潜能。而且，Lee等的方法较为复杂，无法做到简易，大批量而且均一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种3D大脑类器官的制备方法，本发明提供的方法可以得到大小、结构均一的3D大脑类器官，且方法简易，适于产业化。

本发明提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：

将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第 25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养；

所述培养基A包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal 培养基和不含维生素A的B27添加剂；

所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。

本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，保证了99％以上是神经干细胞，从而解决了其他方法含有非神经命运的干细胞及在后续培养中会出现非大脑组织的问题。本发明将神经球打散成为单细胞后计数并按固定数量接种，可以保证细胞团的大小和组成的均一性，即使培养至90天以后3D类脑器官的大小及结构也不会出现显著差异。同时本发明培养过程中使用的培养基A和培养基B确保所培养的3D大脑类器官能被诱导成为前脑，中脑和后脑三个脑区的组织，以及大脑六层皮层的细胞和结构。