[发明专利]3D大脑类器官的制备方法有效
| 申请号： | 201810208751.0 | 申请日： | 2018-03-14 |
| 公开（公告）号： | CN108456659B | 公开（公告）日： | 2020-05-05 |
| 发明（设计）人： | 范靖;王安欣;邹潭 | 申请（专利权）人： | 浙江霍德生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/079 | 分类号： | C12N5/079 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 赵青朵 |
| 地址： | 310018 浙江省杭州市经*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 大脑 器官 制备 方法 | ||
1.一种3D大脑类器官的制备方法，其特征在于，包括：
将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于圆底超低附的细胞培养板上在培养基A中在圆周摇床上培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，用Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，用Matrigel第二次包裹神经球后继续培养；
所述培养基A包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种同等数量的1000～50000个细胞至圆底超低附的多孔细胞培养板上在培养基A中在圆周摇床上培养。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在培养基A中培养的条件为：在37℃，5％CO2细胞培养箱中的低速圆周摇床上摇动培养。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述培养基A包括：1～5μM维甲酸；10～30ng/ml BDNF；10～30ng/ml GDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：10～30ng/ml BDNF；10～30ng/ml GDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养基A包括：2μM维甲酸；20ng/ml BDNF；20ng/ml GDNF；0.2mM抗坏血酸；10μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂；
所述培养基B包括：20ng/ml BDNF；20ng/ml GDNF；0.2mM抗坏血酸；10μM cAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：培养至第85～100天第三次包裹神经球后继续培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，培养至第85～100天用Matrigel第三次包裹神经球后继续培养。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，培养至第30天时，包裹神经球后继续培养至60天，第二次包裹神经球后继续培养至90天第三次包裹神经球后继续培养。
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