[发明专利]对虾肝肠胞虫海藻糖-6-磷酸合成酶及其制备方法

说明书

对虾肝肠胞虫海藻糖‑6‑磷酸合成酶及其制备方法，涉及海藻糖‑6‑磷酸合成酶。通过提取感染对虾肝肠胞虫的对虾的总RNA，进行逆转录，再经过特异性引物扩增，鉴定1个海藻糖‑6‑磷酸合成酶基因。通过pET‑His质粒构建重组原核表达载体，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Plyss中进行重组蛋白表达，纯化包涵体中的蛋白，纯化后的蛋白纯度高，做蛋白复性，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过同源重组表达对虾肝肠胞虫海藻糖‑6‑磷酸合成酶，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、农业等领域奠定基础。

技术领域

本发明涉及海藻糖-6-磷酸合成酶，尤其是涉及对虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose 6-phosphate synthase,TPS)及其制备方法。

背景技术

海藻糖-6-磷酸合成酶在海藻糖代谢过程中发挥着重要作用，是TPS/TPP途径中的关键酶，能够将UDP-葡萄糖(UDPG)上的葡萄糖基转移到6-磷酸葡萄糖上，合成中间产物6-磷酸海藻糖。然后，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(Trehalose 6-phosphate phosphatase,TPP)作用于6-磷酸海藻糖后合成最终产物海藻糖。

海藻糖是一种非还原性二糖，它是由两个葡萄糖通过α,α-1.1-糖苷键连接在一起形成。在生物体内，目前已经发现了5条海藻糖的合成途径，其中，TPS/TPP途径是自然界中分布最广泛的一条海藻糖的合成途径，在真细菌、古生菌、真菌、植物和某些低等无脊椎动物体内都发现了该途径。

海藻糖在食品加工、保健品和生物工程等领域中具有广泛的应用价值。其具有防止淀粉老化、蛋白质变性、稳定细胞组织结构以及保鲜等功能，例如在冷藏罗非鱼片的过程中加入海藻糖可以有效地减缓蛋白质变性的速度，从而提高鱼片的品质。进而在食品中可以作为保鲜剂使用。海藻糖除了可以作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂，例如一定酶量的海藻糖可以提高酵母的耐冻率。海藻糖的这些特性大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。综上所述，海藻糖所具有的各种优良性能，使其广泛的应用于各个行业。虽然，目前海藻糖的生产方法有合成法、发酵法、提取法、酶转化法及基因工程法，但是各种方法仍然存在许多弊端，造成海藻糖大规模生产受多种因素的限制。研究海藻糖相关的合成路径可以为以后海藻糖的大规模生产奠定良好的基础，因此对各路径中所需要的酶的研究至关重要。此外，海藻糖来源广泛，在多种动植物体内都有合成，导致合成海藻糖的酶存在基因序列的多样性和丰富性，因而选择一个性能优良的酶也是一个非常庞大的工程，一旦发现，就能够很好地缓解目前市场上存在的各种问题。

关于TPS/TPP途径(磷酸化酶法)，过去因为磷酸化酶不稳定，所以仅在1998年日本有过商业化生产的报道；而且目前已经发现的植物来源的海藻糖-6-磷酸合成酶TPS基因其蛋白的酶活力还是比较低，在酵母中表达也只能检测到很少的海藻糖积累。

发明内容

本发明的第一目的是提供对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列；

本发明的第二目的是提供对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶蛋白序列；

本发明的第三目的是提供对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因的制备方法。

所述对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆后的核苷酸序列，记为ehpTPS。