[发明专利]一种从人外周血CTC中检测EML4-ALK融合基因亚型荧光定量PCR方法

说明书

本发明涉及肿瘤细胞检测领域，具体涉及一种从人外周血CTC中检测EML4‑ALK融合基因多种常见亚型的荧光定量PCR方法。采用差减法从人外周血中富集CTC，设计并获得EML4‑ALK融合基因亚型特异性引物和特异性Taqman探针，采用荧光定量PCR方法Taqman探针法，EML4‑ALK融合基因亚型阳性质粒标准品为模板进行PCR扩增，并在PCR过程中利用Taqman探针的水解，通过搜集特异荧光信号来检测EML4‑ALK融合基因亚型的表达。有益效果：本技术方案检测结果可用于临床个体化治疗，预测酪氨酸激酶（ALK）抑制剂治疗的有效性，便于临床用药选择，显著提高治疗效果，使患者最大程度受益；同时，还可以避免不合理用药造成的病人医疗费用负担及社会医疗资源浪费，减少不必要的时效损失以及经济损失。

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞检测领域，具体涉及一种从人外周血CTC中检测EML4-ALK融合基因多种常见亚型的荧光定量PCR方法。

背景技术

随着生物分析技术的进步及信息化技术的发展，以及对基于基因医学理解的深入，精准医学（Precision Medicine）的概念从系统医学、转化医学、4P医学等概念中提炼出来，成为一种高度综合且细致的医学新模式，有望提高疾病预防和疾病的治疗水平。据哈佛大学医学院附属波士顿儿童医院教授吴柏林介绍，精准医学源自于基因组学，是指通过基因、分子水平上应用基因组学以及所衍生的各种组学（蛋白质组学、代谢组学、表现基因组学等）来诊断病因或检测出治。随着世界许多主要国家提出精准医学的战略，精准医学已经成为未来医学的发展方向，2015年成为了精准医学的元年，具有重要的历史意义，时至今日，精准医学已成不可以逆转的发展趋势。

液态活检最早由Sorrells于1974年提出，是针对患者体内循环系统的一类非侵入性病理检测方法，能够快捷、无创伤地对肿瘤患者的诊断和治疗监测，当前液态活检技术已逐渐应用在肿瘤诊断治疗当中。对于个体而言，无论是CTC、ctDNA还是外泌体，在病人个体层次存在较大的波动，尤其是在早期，浓度比较低的情况下，ctDNA的检出率明显下降，而CTC目前作为预后评估的主要标准，对于早期肿瘤患者意义不大。迫切需要一种能够对CTC进行定性的液态活检的检测技术和方法。

EML4-ALK融合基因是在2007年由日本学者soda等发现的，当时他们进行了一位62岁的吸烟史的肺腺癌患者的肺切除手术，从他的肺标本中发现了EML4-ALK融合基因，他们通过cDNA克隆构建文库筛选的方法发现了ALK基因的3端和EML4基因的5端相互融合，并通过体外克隆性转化实验以及体内基因重排基础上的肺部选择性表达实验证实：不同的EML4-ALK融合基因亚型都具有恶性转化和致癌性能力。

目前已有一些研究检测了非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因不同亚型的基因表达频率，早期的研究多数集中在亚裔非小细胞患者，亚裔非小细胞患者的不同的EML4-ALK融合基因不同亚型的表达率为2.3%-6.7%，在目前全球已发布的17个报告中，没有选择性的非小细胞肺癌的患者EML4-ALK融合基因的总发生率为3.4%，其中亚裔非小细胞患者为4.1%，日本人，韩国人和中国人分别为3.6%，3.6%和5.9%，而高加索非小细胞肺癌的患者为2.5%。

自新千年以来尤其是近几年，针对非小细胞肺癌的特定的靶点的个体化治疗成为治愈这种癌症的新希望，棘皮动物微管相关蛋白4-间变型淋巴瘤激酶（EML4-ALK）融合基因越来越受到关注，由于它在非小细胞肺癌中的高表达，成为非小细胞肺癌的一个分子标志物，研究表明3%-13%的非小细胞肺癌患者含有此基因，它为非小细胞肺癌的个体化治疗提供了一个新的靶点，目前已经有多个针对该靶点的ALK抑制剂进入了临床研究。

EML4-ALK融合基因几种常见亚型包括亚型1（49.6%）、亚型2（10%）、亚型3a和3b（25.6%）、亚型4、亚型5a和5b、亚型6和亚型7。

EML4-ALK融合基因亚型1（E13;A20）由EML4第13外显子和ALK第20外显子融合而成；