[发明专利]一种rhTNK-tPA细胞收获液的纯化方法

说明书

本发明属于蛋白分离纯化技术领域，具体涉及一种rhTNK‑tPA细胞收获液的纯化方法。本发明其中一个关键点在于将所述rhTNK‑tPA细胞收获液在进行柱层析前先进行深层过滤和除菌过滤，能够有效地解决以往过滤后柱层析填料容易结块的问题，且滤液澄清度高(≤0.3NTU)，过滤损失小(≤5％)，与现有技术相比取得了显著的进步。

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种rhTNK-tPA细胞收获液的纯化方法。

背景技术

注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂(Recombinant Human TNK Tissue-typePlasminogenActivatior for Injection，rhTNK-tPA，商品名：铭复乐)是由广州铭康生物工程有限公司利用DNA重组技术独立研制生产的一种生物制品，临床上用于急性心肌梗死的溶栓治疗，是迄今最安全的第三代溶血栓急救药物。rhTNK-tPA的生产不仅需要高质量的高产细胞株作为基本前提，同时要求有相应的大规模高密度细胞培养技术和大规模高效纯化手段。

现有的纯化工艺中，因rhTNK-tPA的等电点在中性左右，因此第一步一般均先采用离子交换色谱进行层析，主要起到浓缩和部分纯化的作用，接着利用赖氨酸亲和色谱捕捉rhTNK-tPA蛋白，最后使用凝胶过滤，起到除盐以及纯化的作用。如铭康公司日前提交了一件专利申请，其采用以下方法：先将细胞上清经Blue Sepharose 6FastFlow亲和柱层析，然后继续进行赖氨酸亲和层析，最后使用凝胶过滤，经上述层析步骤得到的rhTNK-tPA占总蛋白含量的98％以上，比活可达到50万IU/mg以上。但申请人在实际应用中发现，该方法回收率较低且重复性不够理想。

其次，在实际应用时，发现纯化过程中的层析柱在上样后柱内的填料容易结块，导致填料需要频繁清洗和重新装柱，缩短了填料使用寿命。

因此，有必要提供一种产品回收率高，同时能够克服填料结块的纯化方法。

发明内容

本发明旨在提供一种rhTNK-tPA细胞收获液的纯化方法，该方法回收率高，且经纯化后的一种rhTNK-tPA蛋白占总蛋白含量大于99.0％，最高可达99.6％，比活性可达到62万IU/mg以上，利用该方法纯化rhTNK-tPA，层析柱内的填料不易结块，延长了填料的使用寿命，同时降低了中间品的微生物负荷。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种rhTNK-tPA细胞收获液的纯化方法，将所述rhTNK-tPA细胞收获液在进行柱层析前先进行深层过滤和除菌过滤。

进一步地，所述除菌过滤采用的是0.2μm的除菌过滤器。

进一步地，所述柱层析还包括以下步骤：

A)将过滤后的rhTNK-tPA细胞收获液经Blue Sepharose 6FastFlow亲和柱层析后，用洗脱液Ⅰ洗脱后得到含目标蛋白的洗脱液；

B)将经A)步骤处理得到的含目标蛋白的洗脱液进行Lysine HyperD亲和柱层析，用洗脱液Ⅱ洗脱；

C)将上述含目标蛋白的洗脱液进行Sephadex G-25凝胶过滤，经洗脱液Ⅲ洗脱后即得纯化后的rhTNK-tPA。

进一步地，所述步骤B)和步骤C)调换顺序。

进一步地，所述柱层析还包括以下步骤：

将经Lysine HyperD亲和柱层析得到的rhTNK-tPA经Capto Q阴离子交换树脂柱层析后，用洗脱液Ⅳ洗脱。

进一步地，所述洗脱液Ⅰ由以下浓度的组分组成：20～100mM磷酸盐缓冲液、1～2M氯化钠溶液、2～5M尿素和0.04％吐温80，洗脱液的pH值为7.0～9.0，用量为2.0～4.0倍体积。