[发明专利]一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种合成乳酰‑N‑新四糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌168基因组上重组整合有乳糖透性酶基因，及在枯草芽孢杆菌168中转化有包含β‑1,3‑N‑葡糖氨基转移酶基因和β‑1,4‑半乳糖转移酶基因的质粒。本发明利用枯草芽孢杆菌自身代谢途径中的尿苷二磷酸半乳糖，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸，作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖透性酶的作用下转入细胞，合成乳酰‑N‑新四糖，并分泌到胞外。本发明的重组枯草芽孢杆菌合成乳酰‑N‑新四糖在胞外积累量达到1071mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产乳酰‑N‑新四糖奠定了基础。

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳寡糖(Human Milk OligosaccharideshMOs)是人类母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖和脂肪。由于HMOs在口腔和小肠中不能被分解，所以HMOs是重要的益生元，可以被肠道中的有益微生物菌群利用，促进双歧杆菌的增殖、阻碍病原体的粘附、调节肠道上皮细胞应答、免疫调节等。到目前为止，包括乳酰-N-新四糖在内的HMOs已经在临床实验中被应用到婴儿配方奶粉和食品添加剂中。从乳酰-N-新四糖开始，可以通过岩藻糖基化或唾液酸化进一步得到岩藻糖基或唾液酸基的寡糖。因此，合成乳酰-N-新四糖具有重要的意义。目前发展的化学合成大多需要繁琐的保护、脱保护操作和大量的分离纯化工作，总体合成收率较低；酶法合成方面，酶的来源以及酶严格的底物适应性限制了其在寡糖大量合成中的应用，而且其提取过程中有毒溶剂的使用也不适用于营养品的生产。生物合成因其原料便宜、安全，更适合食品级产品的生产。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是GRAS(generally regard as safe)菌株，其自身代谢途径中包含尿苷二磷酸半乳糖，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸的合成途径，而这两种物质可以作为底物参与合成乳酰-N-新四糖。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过代谢工程改造并发酵合成食品安全级乳酰-N-新四糖，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成乳酰-N-新四糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌168基因组上重组整合有乳糖透性酶基因，及在枯草芽孢杆菌168中转化有包含β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因的质粒。

其中，β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因均来源于脑膜炎双球菌，乳糖透性酶基因来源于大肠杆菌。

优选的，所述质粒为pP43NMK。

第二方面，本发明还提供了一种所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)通过融合PCR构建包含amyE基因同源臂、乳糖透性酶基因、P43启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段；

(2)将β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因连接到质粒上，构建重组质粒；

(3)将步骤(1)得到的重组片段转化枯草芽孢杆菌168，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌mA0；

(4)将步骤(2)构建的重组质粒转化步骤(3)的重组枯草芽孢杆菌mA0，得到合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌。