[发明专利]一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用在审
| 申请号： | 201810206004.3 | 申请日： | 2018-03-13 |
| 公开（公告）号： | CN108410787A | 公开（公告）日： | 2018-08-17 |
| 发明（设计）人： | 刘龙;王淼;陈坚;堵国成;李江华;董晓敏 | 申请（专利权）人： | 光明乳业股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/75;C12P19/18;C12P19/26 |
| 代理公司： | 北京东正专利代理事务所(普通合伙) 11312 | 代理人： | 张伟朴 |
| 地址： | 201103 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组枯草芽孢杆菌 四糖 枯草芽孢杆菌 乳糖 合成 尿苷二磷酸 透性酶 氨基转移酶基因 乙酰氨基葡萄糖 半乳糖转移酶 代谢工程 代谢途径 前体物质 半乳糖 基因组 基因 分泌 构建 外源 整合 质粒 转入 细胞 积累 转化 应用 改造 生产 | ||
1.一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌168基因组上重组整合有乳糖透性酶基因，及在枯草芽孢杆菌168中转化有包含β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因的质粒。
2.根据权利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因均来源于脑膜炎双球菌，乳糖透性酶基因来源于大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述质粒为pP43NMK。
4.权利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：
(1)通过融合PCR构建包含amyE基因同源臂、乳糖透性酶基因、P43启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段；
(2)将β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因连接到质粒上，构建重组质粒；
(3)将步骤(1)得到的重组片段转化枯草芽孢杆菌168，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌mA0；
(4)将步骤(2)构建的重组质粒转化步骤(3)的重组枯草芽孢杆菌mA0，得到合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将P43启动子、博来霉素抗性基因通过融合PCR融合，获得ZP43片段；然后将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因通过融合PCR融合，获得重组片段。
6.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，重组片段的序列如SEQ ID NO.11所示。
7.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO.20所示。
8.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述转化为电转化，电转化的条件为：重组片段的添加量为100-300ng，电压2.5kV，电击试剂5ms。
9.根据权利要求4所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述转化为电转化，电转化的条件为：重组质粒的添加量为100-300ng，电压2.5kV，电击试剂5ms。
10.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌用于发酵生成乳酰-N-新四糖。
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