[发明专利]一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法

说明书

本发明公开了一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，以根腐病原菌侵染大豆，提取大豆总RNA并反转录成cDNA；以cDNA为模板，根据大豆Glyma01g42670.1基因设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获得GmTLP5片段；再通过酶切连接方法将GmTLP5片段克隆到目的载体上，获得重组载体；将重组载体转化根癌农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的GV3101；利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发大豆子叶节，得到抗尖孢镰刀菌根腐病的转基因大豆。本发明提供的方法调控效果显著，结果准确可靠，调控方法操作简单、方便，可公式化，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及基因技术和植物学领域，具体地说，涉及一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法。

技术背景

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)属半知菌类、从梗孢目、瘤座孢科、镰刀菌属，是一种世界性分布的土传病原真菌，其寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌侵染植物根系，会造成根部腐烂，进而影响植物吸收水分和养分的功能，最后导致全株死亡。由尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病会造成大豆严重减产，因此，研究提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法具有重要的理论和应用意义。

病程相关蛋白(PRs)是指由植物寄主的基因所编码，在病理或病理相关的环境下诱导由细胞合成和分泌到液体或细胞间隙的一类低分子量蛋白。PR-5蛋白是PRs蛋白家族中的一类，因其氨基酸序列与西非竹芋的甜蛋白高度同源，被称为类甜蛋白。类甜蛋白在抵抗生物和非生物胁迫中扮演着非常重要的作用，目前已在许多植物上分离出PR-5蛋白，并且不同植物所产生的PR-5蛋白的功能不同，KimY S等人从辣椒里分离的甜蛋白可有效抑制胶孢炭疽菌丝的生长；Wang H X从竹笋中分离出的一种PR-5蛋白能有效抑制灰霉菌丝的生长；Menu-Bouaouiche L从苹果、樱桃中分离的水果甜蛋白具有β-1,3葡聚糖酶活性；而关于大豆病程相关的类甜蛋白家族的研究较少，关于大豆PR-5家族在植物的抗逆性的研究较为滞后，因此，亟待对大豆PR-5基因进行研究，以揭示大豆根系生物学特性和抗逆胁迫机制，获得有效提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明提供一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，通过向大豆中转入GmTLP5(Glyma01g42670.1，PR-5)基因提高大豆对尖孢镰刀菌根腐病的抗性。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，其特征在于：通过转入GmTLP5基因提高大豆对尖孢镰刀菌根腐病的抗性。

一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)植物过表达载体的构建：以根腐病原菌侵染大豆，提取大豆总RNA并反转录成cDNA；以所述cDNA为模板，根据大豆Glyma01g42670.1基因设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获得GmTLP5片段；再通过酶切连接方法将GmTLP5片段克隆到目的载体上，获得重组载体；

(2)转化：将重组载体转化根癌农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的GV3101；利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发大豆子叶节，得到抗尖孢镰刀菌根腐病的转基因大豆。

进一步地，步骤(1)中所述根腐病原菌为腐霉菌、疫霉、尖孢镰刀菌或立枯丝核菌；侵染时间为12-48h并能高度表达GmTLP5基因。

进一步地，步骤(1)中所述引物如下：

GmTLP5-F：CGGGATCCCGATGGTTTACTTGGCACTGTGCT，CGGGATCCCG为BamHI酶切位点；

GmTLP5-R：CGAGCTCGTTACTGGTGGGCGGTACTAGC，CGAGCTCG为SacI酶切位点。