[发明专利]餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法

权利要求书

1.餐饮食品中的一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因型快速检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)菌株的培养鉴定与筛选；

2)DNA模板的提取：

取经筛选的金黄色葡萄球菌，用脑心浸出液肉汤增菌培养，然后，取该增菌液于离心管中，离心，弃上清，加入细菌裂解液，振荡混匀后，置金属浴恒温加热，然后室温离心，将上清液转移到新的离心管中，作为PCR反应模板，-4℃保存备用；

3)PCR扩增：

根据需要检测的金黄色葡萄球菌肠毒素基因型的个数，取相同数量的PCR管，每支PCR管中所需PCR引物对，所述PCR引物对由引物A和引物B组成；然后进行PCR扩增，条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性40秒；55℃退火40秒；72℃延伸1分钟；前述变性、退火和延伸共30个循环；最后72℃延伸10分钟；4℃保温10分钟，得扩增样品；

4)PCR扩增产物分析：

将步骤3)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，取5μL扩增产物与2μL质量比为0.25％的溴酚蓝加样缓冲液混合，混匀之后点样于含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与对应基因型的肠毒素扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应金黄色葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)菌株的培养鉴定与筛选具体为：菌株培养与鉴定参照国标GB 4789.10-2016，按常规方法增菌分离培养，根据菌落形态及血平板溶血现象，通过全自动细菌生化分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌；将纯培养的金黄色葡萄球菌肉汤经VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统检测肠毒素，筛选携带肠毒素的菌株进行下一阶段实验。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为：取筛选的金黄色葡萄球菌，用脑心浸出液肉汤37℃增菌培养15-17h，吸取该增菌液100μL于离心管中，10000-12000r/min条件下离心5-8min，弃上清，加入100μL细菌裂解液，振荡混匀后置100℃金属浴恒温加热14-16min，室温下，10000-12000r/min离心5-7min，将上清液转移到新的离心管中，作为PCR反应模板，-4℃保存备用。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为：每支PCR管中加入1.0μL20μmol/L引物A，1.0μL 20μmol/L引物B；模板DNA:2μL；10×PCR Buffer:2.5μL；MgCl₂25mmol/L：1.5μL；dNTP Mixture：2μL dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mmol/L；Taq酶(2.5U/μL)：1μL；灭菌去离子水：50μL；5000r/min条件下离心3秒，混匀，置于PCR仪内进行扩增。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的PCR引物对为：SEA肠毒素基因型：引物A：AAAGTCCCGATCAATTTATGGCTA；引物B GTAATTAACCGAAGGTTCTGTAGA。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的PCR引物对为：SEB肠毒素基因型：引物A：TCGCATCAAACTGACAAACG；引物B：GCAGGTACTCTATAAGTGCC。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的PCR引物对为：SEC肠毒素基因型：引物A：GACATAAAAGCTAGGAATTT；引物B：AAATCGGATTAACATTATCC。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的PCR引物对为：SED肠毒素基因型：引物A：CTAGTTTGGTAATATCTCCT；引物B：TAATGCTATATCTTATAGGG。