[发明专利]一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法

说明书

本发明公开了一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，以鹅去氧胆酸为起始原料合成熊去氧胆酸的方法。该方法以鹅去氧胆酸为底物，在50mM的磷酸缓冲液中溶解，首先在NAD、NOX2以及通入氧气的情况下，利用7‑α类固醇脱氢酶催化氧化鹅去氧胆酸得到7‑酮基石胆酸；然后在NAD、L‑苹果酸以及苹果酸脱氢酶存在的情况下，利用7‑β类固醇脱氢酶催化还原7‑酮基石胆酸得到熊去氧胆酸。该方法没有使用有机溶剂，操作简单，反应条件温和易控，原料利用率高，转化率高达99％以上。

技术领域

本发明提供一种酶促法催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

熊去氧胆酸化学名称为：3α，7β-二羟基-5β-胆烷酸，与鹅去氧胆酸的分子式相同，立体结构不同，化学上把这两种化合物的结构关系成为同分异构体。熊去氧胆酸是白色结晶粉末，无臭，味苦。易溶于乙醇、氯仿、冰醋酸、稀碱液、略溶于乙醚，难溶于水和稀矿酸，熔点203℃。熊去氧胆酸UDCA是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性地抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并通过激活分裂活性蛋白基酶来增加胆汁淤积的作用。熊去氧胆酸还能竞争性地取代细胞磨合细胞器上的毒性胆酸分子，防止肝细胞和胆管细胞受到更多毒性胆酸的损害。在临床上，熊去氧胆酸主要用于溶解胆固醇型胆结石，原发性胆汁肝硬化PBC，慢性丙型肝炎，同时还用于酒精性肝病，非酒精性脂肪肝、良性复发性肝内胆汁淤积症、先天性内胆管囊性扩张症。

目前国内外主要使用胆酸和鹅去氧胆酸为原料经过多步化学反应制备熊去氧胆酸，反应过程中使用大量的溶剂、氧化剂和还原剂，对环境的污染比较严重；且鹅去氧胆酸转化率较低，后处理复杂。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种工艺简单，合成路线短，转化率高，后处理更容易，环境更友好的熊去氧胆酸制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征包括如下步骤：

A、将鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入磷酸缓冲液溶解，调节溶液pH值，加入NAD、NOX2、7-α类固醇脱氢酶，通入氧气、控制反应温度和反应pH值，反应5小时，反应直到鹅去氧胆酸在溶液中的残留量低于1％，反应完成后升温搅拌，然后降温至常温；

B、反应液中加入L-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶，控制反应温度和反应pH值，反应3小时，反应直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％，反应完成后，加碱升温搅拌，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸结晶得到UDCA。

如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中所述的磷酸缓冲液浓度为50-100mM。

如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中所述的溶液pH值为7.5-8.5。

如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中所述的NAD用量为鹅去氧胆酸重量的0.10-0.30％；所述的NOX2用量为鹅去氧胆酸重量的1.0-3.0％；所述的7-α类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.30-0.50％。

如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中氧气的流速为20-100ml/L/min，反应温度为常温，反应pH值为7.5-8.0。

如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中所述的反应后温度上升至40-80℃；搅拌时间控制在20-60分钟。

如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤B中所述的L-苹果酸钠用量为鹅去氧胆酸重量的40-70％；所述的苹果酸脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的1.0-3.0％；所述的7-β类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.1-0.3％。