[发明专利]一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法。利用本发明构建的质粒载体可以直接将目的蛋白装载于本发明所述载体上，目的蛋白与本发明制备的载体连接后，就形成了intein的C端断裂关键的三个氨基酸Cys‑Phe‑Asn(CFN)。由于在应用Npu split intein进行目的蛋白的纯化时，需要将intein的C片段(I_C)与目的蛋白通过PCR重叠技术融合，该过程操作复杂、耗时长、每一种目的蛋白都需要进行融合。本发明目的蛋白可直接与本发明制备的质粒载体连接，即可将I_C与目的蛋白融合，操作简单，可以重复使用，且I_C和目的蛋白之间避免了引入其他氨基酸。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法。

背景技术

PCR作为分子生物学的一项基本技术，是目前体外DNA扩增最常用的方法，而PCR产物的克隆是对其进行鉴定、扩增以及实现PCR产物多种用途的必经之路。TA克隆是一种利用T载体快速地、一步将PCR产物插入到质粒载体的常用方法。T载体因其3’末端带有突出的T碱基，可直接与PCR扩增产物3’末端突出的A碱基配对，因此提高了PCR产物与载体的连接效率。

断裂内含肽在结构上N端区域(I_N)和C端区域(I_C)相互分离，其基因可以分布在同一个染色体不同的区域，且中间可以相隔很长的基因序列，而当I_N和I_C两个片段连接恢复结构后可按照标准内含肽剪接途径完成两端外显肽的拼接。这一剪接过程称为反式剪接。基于内含肽的断裂反应以及I_N和I_C片段之间亲和识别结合原理，可以将其应用于亲和纯化系统的构建。利用内含肽进行亲和纯化时，需要将I_C片段与目的蛋白基因融合，并且每一种目的蛋白都需要进行一次融合，I_C与目的蛋白的基因融合通常用PCR重叠技术，操作复杂且耗时长。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种人工改造的DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：人工改造的DNA分子，其包括，在野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端人工添加碱基序列，所述人工添加碱基序列，为在利用野生型内含肽Npu split intein基因片段3’端原有序列基础上人工添加碱基序列设计出XcmI酶切位点的基因编码序列，并在所述XcmI酶切位点的序列内部设计出半胱氨酸基因编码序列，得到所述人工改造的DNA分子，所述的人工改造的DNA分子在经过XcmI酶切后，其3’端暴露出半胱氨酸基因编码序列。

作为本发明所述人工改造的DNA分子的一种优选方案，其还包括，在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列。

作为本发明所述人工改造的DNA分子的一种优选方案，其中：在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基，所述人工改造的DNA分子的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种质粒载体。