[发明专利]一种人工改造的DNA分子、质粒载体及其制备方法

权利要求书

1.一种人工改造的DNA分子，其特征在于：包括，在野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端人工添加碱基序列，所述人工添加碱基序列，为在利用野生型内含肽Npusplit intein基因片段3’端原有序列基础上人工添加碱基序列设计出XcmI酶切位点的基因编码序列，并在所述XcmI酶切位点的序列内部设计出半胱氨酸基因编码序列，得到所述人工改造的DNA分子，所述的人工改造的DNA分子在经过XcmI酶切后，其3’端酶切位点处暴露出半胱氨酸基因编码序列。

2.如权利要求1所述人工改造的DNA分子，其特征在于：还包括，在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列。

3.如权利要求1或2所述人工改造的DNA分子，其特征在于：在所述野生型内含肽Npusplit intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npusplit intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基，所述人工改造的DNA分子的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1。

4.一种质粒载体，其特征在于：所述质粒载体上装载了权利要求1～3任一所述的人工改造的DNA分子，所述质粒载体为T载体。

5.如权利要求4所述的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体为对质粒pMD-19-T进行人工改造，所述人工改造，其是将所述质粒pMD-19-T改造为质粒载体pMD-19-Ic-T，其核苷酸序列见序列表SEQ ID No.2。

6.如权利要求4或5所述的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体经过XcmI酶切后暴露出半胱氨酸基因编码序列，与在5’端添加了苯丙氨酸-天冬酰胺二肽的基因编码序列的目的蛋白形成内含肽C端断裂的关键氨基酸半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺基因编码序列。

7.如权利要求6所述的质粒载体，其特征在于：所述目的蛋白的3’端添加Hind III酶切位点的基因编码序列。

8.如权利要求7所述的质粒载体，其特征在于：所述目的蛋白包括绿色荧光蛋白。

9.权利要求4～8任一所述的质粒载体的制备方法，其特征在于：包括，

制备人工改造的DNA分子：在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端添加核苷酸序列TGTTTCATGG，与所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的3’端原有序列CCAAT形成Xcm I酶切位点，其中，核苷酸序列TGT编码半胱氨酸残基；在所述野生型内含肽Npu split intein的C片段基因的5’端添加一个Nde I酶切位点的基因编码序列；

制备质粒载体：将pMD-19-T载体与所述人工改造的DNA分子连接，转化到JM 109感受态细胞，转化产物涂布于氨苄青霉素LB平板上，37℃培养至有单菌落长出，挑取平板中的单菌落培养、提取质粒、酶切、测序鉴定出阳性重组质粒。