[发明专利]在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的方法

说明书

本发明提供一种在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的新方法，其是利用CRISPR/CAS9系统进行基因编辑，通过将MTR值控制在1×10⁵‑5×10⁵的范围内，来提高同源修复效率。其中，所述MTR值为待敲入的外源基因DNA的摩尔数与待打靶基因摩尔数的比值。本发明依据细胞自身的同源修复机制和细胞周期特点，在基因编辑过程中通过增加修复模板DNA的用量，为基因准确修复提供丰富的模板，进而减少非同源末端连接的比例，使得修复的平衡更倾向于同源修复。本方法可使体外培养体细胞的基因修复效率提升到90％以上，比国际现行方法高出30％，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术，具体地说，涉及一种在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的方法。

背景技术

在细胞和活体水平上进行遗传缺陷修复，已经成为了疾病的细胞治疗、新药开发、动物表型改善的首要手段与方法。在任何动物的细胞治疗中，收集动物的活体细胞，在体外进行分离培养、利用基因编辑技术修正缺陷基因、质量控制后回输到动物体内，进而达到治疗某些疾病的目的。细胞治疗已经发展成现代医学的主要发展方向。动物基因编辑主要用于获得生产性能提高、无免疫排斥基因(实现人源化)、生物活性物质的大量产生(生物提取制药)等高附加值的产品，如生物制药中的动物生物反应器、用于异种移植治疗器官衰竭的人源化器官生产、抗烈性传染病的畜禽新品种培育等诸多领域。目前已经获得了白化的基因编辑五指山猪、细毛产量明显增加的基因编辑羊、产肉性能与国际著名肉牛品种相当的基因编辑我国著名的鲁西黄牛等，这些优良性状是常规育种往往需要20年的时间都难以实现的，充分展示了基因编辑技术的巨大优势。

在疾病基因修复或定点插入新基因过程中，如何进行高效修复与定点整合是制约治疗用细胞或基因编辑动物规模化生产的主要障碍。在目前基因编辑的研究中主要侧重于研究CRISPR/CAS9基因本身的功能与活性、编辑效率和脱靶性等方面，而修复领域的研究较少，完全由细胞本身的修复系统完成，人为介入较少，效率难于控制，进展缓慢。目前国际上利用CRISPR/CAS基因编辑技术的同源修复效率仅为30％-60％，难于获得同源修复纯合子，只有通过大量的细胞筛选方能得到纯合子，工作繁杂、任务重、人物力消耗大。因此高效同源修复已成为当前研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的新方法，以解决细胞(含单细胞受精卵)中同源修复效率低，同源修复纯合子比例低，阳性细胞筛选难度大，基因编辑个体成功率低等问题。

本发明的构思如下：在不改变原有基于CRISPR/CAS9技术的基因编辑操作过程的基础上，仅改变其中一个成分的比例，即通过增加待修复基因的同源臂DNA的用量来提高同源修复效率，就可以达到提高同源修复效率之目的。

为了实现本发明目的，本发明提供的在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的方法，其是利用CRISPR/CAS9系统进行基因编辑，通过将MTR值控制在1×10⁵-5×10⁵的范围，来提高同源修复效率。

本发明中，所述MTR值(MTR，Model DNA:Target Ratio)为待敲入的外源基因DNA的摩尔数与待打靶基因摩尔数的比值。

本发明中，所述待修复基因摩尔数的计算方法为：待转染细胞的总数×2×10^-23/6.023。

本发明中，所述待转染细胞为体细胞(如胎儿成纤维细胞)或非人类胚胎细胞(如含单细胞的受精卵)。

本发明中，所述待转染细胞来自于鼠、猪、牛、羊、猪或猴等哺乳动物。

前述方法包括以下步骤：

1)同源臂构建体的制备：将待打靶基因的同源左臂、待敲入的外源基因与待打靶基因的同源右臂顺次连接，即为同源臂构建体；