[发明专利]在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的方法在审
| 申请号： | 201810191682.7 | 申请日： | 2018-03-08 |
| 公开（公告）号： | CN108441519A | 公开（公告）日： | 2018-08-24 |
| 发明（设计）人： | 李岩;于坤;连正兴;邓守龙;连玲 | 申请（专利权）人： | 中国农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;黄爽 |
| 地址： | 100193 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 同源 基因 修复 修复效率 摩尔数 非同源末端连接 基因修复 体外培养 外源基因 细胞周期 效率提升 模板DNA 体细胞 细胞 平衡 应用 | ||
1.在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的方法，其特征在于，利用CRISPR/CAS9系统进行基因编辑，通过将MTR值控制在1×105-5×105的范围，来提高同源修复效率；
其中，所述MTR值为待敲入的外源基因DNA的摩尔数与待打靶基因摩尔数的比值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待打靶基因摩尔数的计算方法为：待转染细胞的总数×2×10-23/6.023。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待转染细胞为体细胞或非人类胚胎细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)同源臂构建体的制备：将待打靶基因的同源左臂、待敲入的外源基因与待打靶基因的同源右臂顺次连接，即为同源臂构建体；
2)CAS9 mRNA的合成；
3)sgRNA的合成；
4)采用脂质体介导的方法将上述同源臂构建体、CAS9 mRNA和sgRNA共同转染体细胞，或者采用显微注射的方法将上述同源臂构建体、CAS9 mRNA和sgRNA共同显微注射至胚胎细胞；
5)中靶细胞的鉴定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中同源左、右臂大小分别为50-1000bp，待敲入的外源基因大小为1kb-7kb。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中同源左、右臂为等长。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中采用脂质体介导的方法将所述同源臂构建体、CAS9 mRNA和sgRNA共同转染体细胞，其中CAS9 mRNA和sgRNA的摩尔比为1:2。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中采用显微注射的方法将CAS9mRNA和sgRNA共同显微注射至胚胎细胞，其中CAS9 mRNA和sgRNA的摩尔比为1:2。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待转染细胞来自于鼠、猪、牛、羊、猪或猴。
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