[发明专利]一种分析辣木亲缘关系的反应体系、试剂盒及其应用方法

说明书

本发明提供了一种分析辣木亲缘关系的反应体系、试剂盒及其应用，本发明提供的技术方案通过SRAP分子标记技术从170对引物中筛选出13对多态性好、清晰度高的引物，对18份辣木DNA进行标记，使用NTSYS软件完成对数据的分析和UPGMA聚类，进一步研究辣木亲缘关系和遗传多样性。结果表明：不同辣木品系间存在丰富的遗传多样性，SRAP分子标记是一种适合用于辣木种质亲缘关系分析的有效手段，能够为辣木分子辅助育种和遗传图谱数据库建立提供重要的技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种分析辣木品系亲缘关系的试剂盒及其应用。

背景技术

辣木(Moringa oleifera)系辣木科辣木属植物，为多年生热带常绿乔木，原产于印度和非洲，具有独特的经济价值和营养保健作用。辣木各个部位均可食用或入药，因其含有较高的蛋白质、维生素和矿物质而在多个发展中国家广泛种植。辣木在全世界约有13个种，随着人们对辣木功效和营养价值的认可，近年来，在我国云南、海南、四川、广东、贵州和福建等多地快速推广种植，但一些地方盲目种植、品种名称混乱的现象时有发生。

随着分子标记技术的发展，多种实验技术已被广泛应用到种质资源评价、遗传多样性分析和图谱构建等方面。而SRAP(sequence related amplified polymorphism)因较好的重复性、较强的多态性，共显性标记系统和操作简便等特点，成为植物亲缘关系和遗传多样性分析的有效手段，已在小麦、芦笋、枸杞、大豆等植物中应用于亲缘关系分析、基因定位、遗传图谱构建和基因克隆等辅助育种研究中。SRAP分子标记所使用的引物、PCR反应程序较为通用，无需基因组或转录组信息等突出优势，使得其特别适用于遗传背景不十分清楚的植物亲缘关系分析的研究。但SRAP分子标记受PCR反应体系和物种水平影响较大。

目前，还未有报道采用SRAP分子标记对辣木品系亲缘关系进行分析的相关研究。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种基于SRAP分子标记分析辣木亲缘关系的试剂盒。本发明提供的辣木品系亲缘关系分子鉴定方法，可对辣木品系进行快速、准确鉴定。

本发明提供一种辣木亲缘关系分析的试剂盒及其应用，步骤包括：

(1)采用辣木基因组DNA为模板，保存于-20℃备用；

(2)采用上述SRAP-PCR体系对(1)中的DNA进行扩增；

(3)将扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳，成像系统拍照保存；

(4)利用13对SRAP分子标记将不同品系辣木进行聚类分析。

进一步地，步骤(1)中的辣木基因组DNA采用改良CTAB法提取，储存于-20℃备用，扩增前稀释成20ng/μl的工作浓度；

进一步地，步骤(2)中的PCR反应体系具体25μl反应液包含，不含Mg²⁺的10*PCRbuffer2.5μl，Mg²⁺2mM，dNTPs 0.2mM，DNA浓度为40ng，Taq DNA聚合酶用量为0.625U，上下游引物各0.75μmol；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性1min，37℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环反应，再94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环反应，72℃再延伸10min，4℃保存。

进一步地，步骤(3)中的电泳具体为取5μL反应液进行质量体积比为2.0％的低熔点琼脂糖凝胶电泳，在0.5×电泳缓冲液环境中，100V稳压电泳1.5h，然后用凝胶成像系统观察并拍照。