[发明专利]一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法

说明书

本发明公开了一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法。本发明提供的载体包括含有牛KDM4E基因的体外转录模板载体。载体经体外转录反应可获得大量牛KDM4E基因的mRNA，再将其注入到成功融合并激活的牛体细胞克隆胚胎中，使胚胎过量表达牛KDM4E蛋白。本发明可以有效减弱体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白H3K9me3和H3K9me2表观遗传修饰水平，从而显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可用以高效体外生产牛体细胞克隆胚胎，胚胎移植后克隆牛的出生率也显著提高。

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法。

背景技术

体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆、疾病模型、人类器官移植、动物转基因研究、濒临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核未被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化，这些表观遗传修饰主要包括组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化和DNA甲基化三方面。

尽管组蛋白甲基化等表观遗传修饰在动物胚胎发育中广泛存在，但是，目前尚未有研究从克隆胚胎和受精胚胎之间表观遗传修饰差异的角度，揭示表观遗传修饰与内源蛋白表达水平的关系，导致对于如何提高动物胚胎体外发育效率，仍缺乏明确且行之有效的解决策略，特别是利用KDM4家族基因差异表达提高牛体细胞克隆胚胎发育率、囊胚细胞数和出生率的作用尚未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种体外转录模板载体，该载体包括用于表达目的序列的重组基因表达盒，所述目的序列包括KDM4E基因，该基因具有编码去组蛋白H3K9甲基化酶KDM4蛋白家族中严格保守的决定酶活性的关键位点序列。

优选的，所述目的序列还包括与所述KDM4E基因串联表达的绿色荧光蛋白EGFP基因。

优选的，所述重组基因表达盒还包括位于所述目的序列上游的Kozak序列。Kozak序列是真核生物转录所得mRNA上较为保守的序列，它可以促进mRNA有效地与核糖体结合，保证翻译的正常进行。

优选的，所述KDM4E基因选自牛KDM4E基因读码框。

优选的，所述KDM4E基因如SEQ.ID.NO.1所示。

优选的，所述载体具体包括作为骨架的pcDNA3.1(+)载体以及插入在pcDNA3.1(+)载体多克隆位点区内的上述重组基因表达盒，该重组基因表达盒采用pcDNA3.1(+)载体所含T7启动子启动目的序列表达，还包括依次排列于pcDNA3.1(+)载体所含T7启动子之后的Kozak序列、绿色荧光蛋白EGFP基因读码框及牛KDM4E基因读码框。

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的牛体细胞克隆胚胎处理方法，该处理方法包括以下步骤：

经体外转录反应获得转录自目的序列的mRNA，所述目的序列包括KDM4E基因，该基因具有编码去组蛋白H3K9甲基化酶KDM4蛋白家族中严格保守的决定酶活性的关键位点序列；再将所述mRNA注入到完成融合及激活处理的牛体细胞克隆胚胎中，使该胚胎过量表达KDM4E蛋白。

优选的，所述mRNA注入时间为牛体细胞克隆胚胎的合子激活期之前。

优选的，所述处理方法具体包括以下步骤：

1)目的序列的体外转录