[发明专利]一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法

权利要求书

1.一种体外转录模板载体，其特征在于：该载体包括用于表达目的序列的重组基因表达盒，所述目的序列包括KDM4E基因，该基因具有编码去组蛋白H3K9甲基化酶KDM4蛋白家族决定酶活性的关键位点序列。

2.根据权利要求1所述一种体外转录模板载体，其特征在于：所述目的序列还包括与所述KDM4E基因串联表达的绿色荧光蛋白EGFP基因。

3.根据权利要求1所述一种体外转录模板载体，其特征在于：所述重组基因表达盒还包括位于所述目的序列上游的Kozak序列。

4.根据权利要求1所述一种体外转录模板载体，其特征在于：所述KDM4E基因选自牛KDM4E基因读码框。

5.根据权利要求1或4所述一种体外转录模板载体，其特征在于：所述KDM4E基因如SEQ.ID.NO.1所示。

6.根据权利要求1所述一种体外转录模板载体，其特征在于：所述载体具体包括作为骨架的pcDNA3.1(+)载体以及插入在pcDNA3.1(+)载体多克隆位点区内的依次排列于pcDNA3.1(+)载体所含T7启动子之后的Kozak序列、绿色荧光蛋白EGFP基因读码框及牛KDM4E基因读码框。

7.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的牛体细胞克隆胚胎处理方法，其特征在于：该处理方法包括以下步骤：

经体外转录反应获得转录自目的序列的mRNA，所述目的序列包括KDM4E基因，该基因具有编码去组蛋白H3K9甲基化酶KDM4蛋白家族决定酶活性的关键位点序列；再将所述mRNA注入到完成融合并激活的牛体细胞克隆胚胎中，使该胚胎过量表达KDM4E蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述mRNA注入时间为牛体细胞克隆胚胎的合子激活期之前。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述处理方法具体包括以下步骤：

1)目的序列的体外转录

在骨架载体中插入KDM4E基因、绿色荧光蛋白EGFP基因以及位于前端的Kozak序列；然后将所述载体经线性化处理后进行体外转录，得到用于融合表达KDM4E基因和绿色荧光蛋白EGFP基因的稳定的mRNA，将该mRNA稀释至800～1200ng/μL；

2)基于体细胞核移植构建牛体细胞克隆胚胎

将牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，将供体细胞注入去核的牛卵母细胞中得到重构体，对重构体进行融合处理，对融合得到的牛体细胞克隆胚胎进行激活处理；

3)mRNA注入及牛体细胞克隆胚胎培养

对经过激活处理的牛体细胞克隆胚胎进行恢复培养，然后将步骤1)所得mRNA按照8～10pL的剂量通过显微注射注入所述牛体细胞克隆胚胎；将注入mRNA的牛体细胞克隆胚胎持续培养至8细胞期或囊胚期。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，KDM4E基因选自牛KDM4E基因读码框，以pcDNA3.1(+)表达载体作为骨架载体；

所述步骤2)中，在对重构体进行电融合后1～1.5h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚胎进行以下激活处理：先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中于25℃孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中培养4～4.5h；

所述mSOF溶液以SOF溶液为基础培养液，还含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

所述电融合包括以下步骤：将重构体于电融合液中预平衡3min；然后施加电击1次，电击采用的电压为35V，脉冲时间为10μs；

所述步骤3)中，恢复培养包括以下步骤：将牛体细胞克隆胚胎经激活处理后转移到mSOF溶液中培养1.5～2h；显微注射时将牛体细胞克隆胚胎置于含体积分数10％FBS的M199培养液中；所述持续培养包括以下步骤：将18～20枚经显微注射处理的牛体细胞克隆胚胎继续在120～150μL mSOF溶液中培养至72～96h，然后吸除60～75μL培养液，补加60～75μL的新鲜mSOF溶液，继续培养至第7～8d。