[发明专利]一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法

说明书

本发明公开了一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下具体制备步骤：肾脏初步处理、肾脏脱细胞灌注、肾脏冲洗、脱水灭菌、搅拌消化、成胶。本发明利用灌注法通过肾动脉置管进行冲洗脱细胞，根据血管的分布，脱细胞液能够达到几乎每一处肾脏组织，使得脱细胞更加充分。且细胞破裂后的成分可随着液体流动，及时排出，脱细胞效率更高，大大减少可能的细胞内成分的残留，而且使用Triton X‑100和Type I DNase I联合灌注，既对细胞核成分进行充分洗脱，也最大限度保留了肾脏ECM的生物活性成分，使其能够发挥更好的生物学作用。

技术领域

本发明涉及水凝胶制备技术领域，特别涉及一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法。

背景技术

干细胞移植已成为肾脏损伤修复的一种重要手段，主要包括两种方式：经外周血管注射移植和局部注射移植。经外周血管注射移植虽然操作方便，但能够达到靶器官的干细胞数量较少，且可能导致全身不良反应；局部注射移植虽然可保证较高的靶器官干细胞移植率，但干细胞的存活率较低，且部分会随血流移出靶器官

细胞外基质(ECM)水凝胶可显著提高干细胞的滞留率和存活率，增强干细胞的组织修复能力。但现存的细胞外基质获得方法，多洗脱不充分或对ECM损伤较大，且肾脏源性ECM水凝胶的制备，目前尚没有报道。因此，发明一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种温敏型肾脏细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下具体制备步骤：

一、肾脏ECM的制备：

步骤一：肾脏初步处理：取动物肾脏，保留肾蒂结构，并且进行肾动脉置管，然后予以500ml双蒸水快速灌注冲洗2h，以去除肾脏血管中残留的血液成分；

步骤二：肾脏脱细胞灌注：当冲洗结束后，利用1000ml的Triton X-100快速灌注4h后，再用1000ml的Triton X-100持续缓慢灌注12h，当Triton X-100灌注完成后，利用50U/ml Type I DNase I液快速灌注4h；

步骤三：肾脏冲洗：当漂洗结束后，用双蒸水灌注冲洗2h，去除肾脏内残余TritonX-100和Type I DNase I液；

二、肾脏ECM水凝胶的制备：

步骤一：脱水灭菌：当肾脏ECM的制备完成之后，将肾脏在冷冻干燥机中脱去水分，并且剪碎呈粉末状，同时导入环氧乙烷气体进行灭菌；

步骤二：将粉末状的肾脏ECM溶于含胃蛋白酶的0.1M盐酸中，并且在室温条件下搅拌消化；

步骤三：成胶：当步骤二完成之后，向内加入1/9溶液总体积的灭菌10xPBS，并且利用灭菌1xPBS调整最终ECM水凝胶浓度为15mg/ml。

优选的，肾脏ECM的制备的步骤一中动物肾脏为新鲜肾脏，且从动物体内取出时间为10min～60min。

优选的，肾脏ECM的制备的步骤二中Triton X-100浓度设置为0.5％～1.5％，50U/ml Type I DNase I液是由10mM Tris-base、2mM MgCl2、2mM CaCl2和150mM NaCl混合而成，且Type I DNase I液pH值呈7.6。

优选的，肾脏ECM水凝胶的制备步骤一中冷冻干燥机温度保持在-30℃～-50℃之间。

优选的，肾脏ECM水凝胶的制备步骤二中搅拌消化时间设置为48h，并且消化结束后，加入1M的NaOH调整溶液的pH值至7.4。