[发明专利]一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法

说明书

本发明公开了一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，该方法包括花药愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、丛生芽生根培养、组培苗壮苗培养基、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率等步骤，在进行组织培养过程中采用特定的培养基，特定的培养基为在常规培养基配方上利用以海藻糖代替蔗糖并添加黑果枸杞汁过滤液营养成分配制出来的培养基，培养完成后采用利用分子标记技术进行脱毒鉴定。本发明显著提高脱毒率，操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

技术领域

本发明涉及农作物育种技术领域，尤其涉及一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，通过花药培养途径进行高效脱毒，并用分子标记技术快速检测脱毒率。

背景技术

中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。黄瓜任一病害的流行，都可能使品质下降、产量显著降低，严重时近乎绝产。化学防治虽然对真菌和细菌性病害有较好的防效，但对于病毒病至今仍缺乏高效药物。因此，黄瓜脱病毒苗的培育是十分重要的。

黄瓜病毒病是20世纪六、七十年代骤然爆发并逐渐在世界各地蔓延。近年来，在保护地栽培生产中黄瓜病毒病发生非常严重，且有日益加剧的趋势。温室黄瓜感染病毒后，产量将下降64％～85％。据研究报道黄瓜花叶病毒(CMV)和西瓜花叶病毒(WMV)是侵染我国华北黄瓜的主要病毒，侵染率高达96.94％和77.55％。番木瓜环斑病毒西瓜株系(CGMMV)是中国重要的农业植物检疫性有害生物。但是目前对于病毒病仍缺乏高效药物，因此，黄瓜脱病毒苗的培育显得尤为重要。

发明内容

本发明的发明原理：本发明主要利用特定的培养基来进行花药单倍体培养，能够显著提高花药单倍体的成功率，减少和消除CMV、WMV和CGMMV病毒，并用分子标记技术快速检测脱毒效率。

本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，将海藻糖、黑果枸杞汁过滤液和三十烷醇应用于培养中，可提高愈伤组织诱导率并生产健壮组培苗。脱毒苗用分子标记技术快速准确鉴定脱毒效果。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，包括以下步骤：

a.花药愈伤组织诱导培养：选取黄瓜花药长度0.2～0.3厘米的花蕾为外植体，将花蕾在4℃条件下处理4天；花蕾用流水冲洗10～20分钟，进行消毒后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中；

其中愈伤组织诱导培养基：三十烷醇0～3.0mg·L^-1、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.2～0.8mg·L^-1和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.3～0.7mg·L^-1、海藻糖30g·L^-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L^-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；

b.愈伤组织分化培养：将步骤a中培育的愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽；

其中愈伤组织分化培养基：三十烷醇1～3mg·L^-1和6-BA 0.3～0.7mg·L^-1、海藻糖30g·L^-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L^-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；

c.丛生芽生根培养：将步骤b中高1.8～2.2cm的丛生芽转入生根培养基；

其中生根培养基：IBA(吲哚丁酸)0.2～1mg·L^-1、海藻糖30g·L^-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L^-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；