[发明专利]岩藻糖基化抗体的分离方法

说明书

本发明涉及抗体的分离方法，具体为具有不同岩藻糖基化程度的抗体的分离方法。所述方法基于抗体对Fc受体的结合亲和力。本发明进一步涉及Fc受体用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的用途。

本申请为2012年10月16日提交的，发明名称为“岩藻糖基化抗体的分离方法”的PCT申请PCT/EP2012/070439的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2014年4月21日，申请号为201280051644.2。

发明领域

本发明涉及抗体的分离方法，具体为具有不同岩藻糖基化程度的抗体的分离方法。所述方法基于抗体对Fc受体的结合亲和力。本发明进一步涉及将Fc受体用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体。

背景

人IgG₁由两种Fab(抗原结合片段)片段组成，所述片段包含负责抗原识别的可变区，以及与免疫系统的组分相互作用并介导免疫效应子功能的恒定Fc(可结晶片段)结构域，所述免疫效应子功能例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。连接到恒定区的CH2结构域内在天冬酰胺297(Asn297，N297)处的保守的N-糖基化位点的碳水化合物结构对于介导这些效应子功能而言是必需的(1-4)。

天然地，连接到Fc结构域的寡糖主要是在平分型GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)、末端半乳糖、核心岩藻糖和唾液酸的含量方面不同的双触角(biantennary)复合型结构(图1)。

近期研究已显示，碳水化合物组合物的修饰强烈影响抗体介导的免疫效应子功能(3-5)。低水平的半乳糖基化积极影响补体激活，同时缺乏核心岩藻糖导致对FcγRIIIa更高的结合亲和力并由此增强ADCC(5-7)。已经开发了多种方法以调控糖基化特征以及生成具有改进的生物功能的治疗性抗体(8-10)。

例如，过表达β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶(GnT)III和甘露糖苷酶(Man)II的哺乳动物细胞中产生的糖改造的抗体以高比例的二等分、非岩藻糖基化寡糖为特征，并且由于对FcγRIIIa多达50倍的更高亲和力而引起增强的ADCC(9)。然而，通过GnT III的过表达引入的碳水化合物修饰抑制岩藻糖基化反应，所述碳水化合物修饰导致仅部分非岩藻糖基化的抗体。由于IgG分子的Fc结构域带有两个N-连接糖基化位点，岩藻糖基化反应的部分抑制可导致抗体库内岩藻糖的分布改变。此类抗体制剂可能含有带有一个或两个岩藻糖残基的分子的混合物，而它们中的一些是完全非岩藻糖基化的。显然，此类非岩藻糖基化的不同程度影响对FcγRIIIa的总体亲和力并导致不同生物活性。因此，此类抗体库的详细鉴定是必需的。

岩藻糖基化和非岩藻糖基化IgG对FcγRIIIa的亲和力之间的差异为至多50倍，因此可以利用该相互作用来分离抗体库中不同岩藻糖基化的种类并独立地表征它们。

用于IgG纯化的现有亲和层析基质不能区分IgG库中不同的糖基化模式，因为固定化捕获蛋白质特异性结合抗体的蛋白质骨架。例如蛋白质A和蛋白质G在Fc区的CH2和CH3结构域之间的界面内结合，而其它IgG特异性蛋白例如蛋白质L识别kappa轻链的恒定部分(11-13)。

已经采用凝集素亲和层析，例如使用结合含有岩藻糖的聚糖的橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)以富集带有特异性聚糖结构的蛋白质(14)。可选地，已经使用识别特异性碳水化合物结构的聚糖-靶向抗体，例如Lewis x抗原的特异性抗体(15)。尽管这些方法可适于富集带有特异性碳水化合物的糖蛋白，然而所述方法对于缺乏特异性碳水化合物的糖蛋白，例如非岩藻糖基化的抗体的富集用途有限。此外，这些方法对于抗体都不是特异性的，因此在将抗体库应用至亲和力基质之前要求严格纯化所述抗体库，以避免受其它带有靶向聚糖结构的蛋白质污染。最终，这些方法依赖于可能难以获得的特异性凝集素或抗体，并且所述方法尚未成功用于制备目的。