[发明专利]肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法

说明书

本发明公开了一种肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，该方法中目标基因包括58个肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因；该方法至少包括如下步骤：步骤1：制备58个HRD基因全外显子区域探针；步骤2：捕获58个目标基因DNA；步骤3：进行洗脱程序；步骤4：PCR反应体系进行捕获目标DNA后扩增；步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用qubit定量至20ng/ul，分装保存。本发明的探针制备方法针对58个基因捕获，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等同源重组修复缺陷多基因的捕获检测。

技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞DNA损伤后同源重组修复缺陷基因突变与错配基因修复缺陷的捕获测序的探针制备方法。可用于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及胰腺癌的遗传风险评价及靶向药物检测。

背景技术

新一代测序技术的发展，为现代基因组学的研究打开了新的局面，然而基因组测序的成本和分析的复杂程度还是让研究人员倍感困难，目标序列捕获技术的出现，缓解了这些问题。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针后进行的测序。外显子组捕获测序则是其中的一个特例，它是专门针对基因组中全部外显子区域的研究。多基因全外显子测序是利用序列捕获技术将多基因全外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度，能发现外显子区绝大部分疾病相关变异以及仅需要对约1％的基因组进行测序等优点，促使多基因全外显子测序成为鉴定如孟德尔疾病等疾病的致病基因最有效的策略，也被运用于复杂疾病易感基因的研究和临床诊断中。

目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定片段。从这个定义看，目标片段的PCR也是目标序列捕获的一种，不过这种方法通量小，目前一次PCR获取最长的基因组DNA片段不超过50Kb，而且需要特殊的酶和特殊的PCR条件，成本昂贵，稳定性差。另一种捕获方法是根据核酸分子碱基互补的探针，将这些探针固定在某些支持物上，用于分离，然后打断基因组DNA，加上街头后与探针杂交，洗脱为杂交上的DNA，回收目标DNA片段，可直接建库进行DNA测序。

本方法实验过程简单，价廉。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，该方法中目标基因的捕获探针，为生物素标记的目标基因的特异性探针组，所述目标基因包括如下58个肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因：RAD50、RAD51、RAD51D、RAD51C、RAD51B、Rad52、BRIP1、BARD1、BAP1、WRN、FANCA、FANCD2、FAM175A、CHEK2、CHEK1、ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、NBN、PALB2、MRE11A、XRCC3、CDK12、c11orf30、CCNE1、FANCC、FANCI、POLQ、MMS22L、RMI2、TP53、PTEN、STK11、PI3K、TSC1、TSC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、POLE、JAK1、JAK2、NF1、NOTCH1、KRAS、MDM2、MDM4、DNMT3A、B2M、TS、ERCC2、ERCC6、MSH4、FANCM、CEP164；该方法至少包括如下步骤：

步骤1：制备58个HRD基因全外显子区域探针；

步骤2：捕获58个目标基因DNA；

步骤3：进行洗脱程序；

步骤4：PCR反应体系进行捕获目标DNA后扩增；

步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用qubit定量至20ng/ul，分装保存。

进一步，在所述的步骤2中，至少包括如下分步骤：

步骤2.1：合成12K不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含200bp目标区域和通用的15个碱基末端：