[发明专利]肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法

权利要求书

1.肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：该方法中目标基因的捕获探针，为生物素标记的目标基因的特异性探针组，所述目标基因包括如下58个肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因：RAD50、RAD51、RAD51D、RAD51C、RAD51B、Rad52、BRIP1、BARD1、BAP1、WRN、FANCA、FANCD2、FAM175A、CHEK2、CHEK1、ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、NBN、PALB2、MRE11A、XRCC3、CDK12、c11orf30、CCNE1、FANCC、FANCI、POLQ、MMS22L、RMI2、TP53、PTEN、STK11、PI3K、TSC1、TSC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、POLE、JAK1、JAK2、NF1、NOTCH1、KRAS、MDM2、MDM4、DNMT3A、B2M、TS、ERCC2、ERCC6、MSH4、FANCM、CEP164；该方法至少包括如下步骤：

步骤1：制备58个HRD基因全外显子区域探针；

步骤2：捕获58个目标基因DNA；

步骤3：进行洗脱程序；

步骤4：PCR反应体系进行捕获目标DNA后扩增；

步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用qubit定量至20ng/ul，分装保存。

2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤2中，至少包括如下分步骤：

步骤2.1：合成12K不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含200bp目标区域和通用的15个碱基末端：

5′-ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3′；

步骤2.2：把合成的寡核苷酸库溶于500ul的低浓度TE溶液；

步骤2.3：每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度；

步骤2.4：用5％胶跑PCR产物，然后回收230bp大小的PCR产物，溶解到100ul水中；

步骤2.5：通过PCR进行解连，得到带生物素的单链的寡核苷酸片段。

3.根据权利要求2所述的肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤2.3中，

引物序列具体为：

A 5′Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3′

B 5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′。

4.根据权利要求2所述的肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤2.3中，扩增条件为：制备3个50ul PCR反应体系，模板分别为1ul，2ul，5ul；

PCR反应条件：95℃5min；95℃30S；60℃2min。

5.根据权利要求1所述的肿瘤细胞DNA损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：在所述的步骤3中，至少包括如下分步骤：

步骤3.1：制备如下混合液：4ul 500ng DNA库、2ul 200uM的Adaptor Block及6ulcapture probe；

步骤3.2：在PCR仪中，95℃5min，60℃5min；

步骤3.3：加入10ul 60℃预热的2X杂交液；

步骤3.4：在PCR仪上60℃杂交24h。