[发明专利]猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒，包括96孔抗原包被化学发光板、标准阴性血清、标准阳性血清、酶标猪二抗、血清稀释液、化学发光底物液；本发明还公开了所述试剂盒进行猪瘟病毒抗体化学发光检测方法，本发明将猪瘟E^rns、E2蛋白抗原结构域在E.Coli高效表达，成功将蛋白复性为具有功能的可溶性蛋白，既解决了非特异性反应的问题，又能检测针对不同线性表位、构像表位的抗体；与国内现有CSFV抗体检测试剂盒比较，本发明的试剂盒具有检测时间短、重复性好、特异性强等特点，同时提高了检测敏感性以及检测结果的符合率。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

目前国内现有的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法主要有猪瘟间接血凝、正向间接血凝，间接ELISA、单抗阻断ELISA等方法；其中所使用的血凝检测试剂盒敏感性差，符合率低，无法客观地反应猪群针对猪瘟免疫的抗体水平；单抗阻断ELISA只是针对E2蛋白的单一表位，虽然特异性高，但当猪体针对该表位的抗体丰度不足时，检测结果会有假阴性产生；而间接ELISA试剂盒，有的是表达抗原单个表位的重复序列，有的是合成的表位肽段，这些蛋白作为诊断抗原容易漏检，且产品稳定性差，检出结果符合率低，无法准确判断猪瘟抗体的免疫保护水平。针对以上问题，并没有行之有效的检测方法或试剂盒来解决，本发明原核诱导表达了猪瘟结构蛋白构象依赖的抗原结构域，经IDEXX试剂盒单抗和猪瘟阳性多抗血清验证，该蛋白具有良好的反应原性，且生产成本低于真核表达的蛋白，生产工艺简便易行，同时以该蛋白为诊断抗原的检测方法大大缩短了检测时间，提高了样品的检出率和检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒及其检测方法，旨在解决上述背景技术中现有猪瘟病毒抗体检测试剂盒重复性差，检测结果符合率低，无法客观反应猪群针对猪瘟免疫的抗体水平的问题。

本发明是这样实现的，一种猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒，该试剂盒包括96孔抗原包被化学发光板、标准阴性血清、标准阳性血清、血清稀释液、酶标猪二抗、化学发光底物液，所述试剂盒在进行猪瘟病毒抗体化学发光检测过程中，洗涤后的抗原包被化学发光板中需加入酶标板稳定剂封闭。

优选地，所述96孔抗原包被化学发光板中抗原为E^rns、E2蛋白抗原，抗原包被浓度为200ng/孔，包被条件为4℃过夜。

优选地，所述酶标板稳定剂为20mmol/L Na₂HPO₄+50mmol/L NaCl+5mmol/L EDTA+体积分数为5％的小牛血清。

优选地，所述血清稀释液为20mmol/L Na₂HPO₄+100mmol/L NaCl+体积分数4％的小牛血清+体积分数为0.1％的Tween₂₀+体积分数为2％的E.Coli裂解液。

本发明进一步提供了一种利用上述试剂盒进行猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测方法，该检测方法包括如下步骤：

(1)CSFV E^rns、E2蛋白抗原结构域的原核诱导表达；

CSFV E^rns蛋白100-145aa+GGSSGG+E2蛋白N端145aa通过NdeI、XhoI酶切位点克隆至PET-30a载体，阳性质粒转化至BL21 DE3 plysS菌株，卡纳抗性LB平板37℃培养筛选单克隆，培养诱导后收集菌液；

(2)蛋白纯化

纯化过程中用蛋白复性液将蛋白低温透析复性，蛋白复性液为50mmol/L Tris+50mmol/L NaCl+体积分数为5％的甘油+0.5mmol/L EDTA+质量体积分数为0.1％的PEG6000；