[发明专利]猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括96孔抗原包被化学发光板、标准阴性血清、标准阳性血清、血清稀释液、酶标猪二抗、化学发光底物液，所述试剂盒在进行猪瘟病毒抗体化学发光检测过程中，洗涤后的抗原包被化学发光板中需加入酶标板稳定剂封闭。

2.如权利要求1所述的猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒，其特征在于，所述96孔抗原包被化学发光板中抗原为E^rns、E2蛋白抗原，抗原包被浓度为200ng/孔，包被条件为4℃过夜。

3.如权利要求1所述的猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板稳定剂为20mmol/L Na₂HPO₄+50mmol/L NaCl+5mmol/L EDTA+体积分数为5％的小牛血清。

4.如权利要求1所述的猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液为20mmol/L Na₂HPO₄+100mmol/L NaCl+体积分数4％的小牛血清+体积分数为0.01％的Tween₂₀+体积分数为2％的E.Coli裂解液。

5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行猪瘟病毒抗体间接化学发光定性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(1)CSFV E^rns、E2蛋白抗原结构域的原核诱导表达

CSFV E^rns蛋白100-145aa+GGSSGG+E2蛋白N端145aa通过NdeI、XhoI酶切位点克隆至PET-30a载体，阳性质粒转化至BL21DE3plysS菌株，卡纳抗性LB平板37℃培养筛选单克隆，培养诱导后收集菌液；

(2)蛋白纯化

纯化过程中用蛋白复性液将蛋白低温透析复性，蛋白复性液为50mmol/L Tris+50mmol/L NaCl+体积分数为5％的甘油+0.5mmol/L EDTA+质量体积分数为0.1％的PEG6000；

(3)纯化抗原包被96孔化学发光板；

(4)加入酶标板稳定剂封闭；

(5)待检血清经稀释后加入化学发光板温育，再加入酶标猪二抗温育后加入化学发光底物液，37℃作用5min后读取化学发光值。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述酶标板稳定剂为20mmol/L Na₂HPO₄+50mmol/L NaCl+5mmol/L EDTA+体积分数为5％的小牛血清，封闭条件为37℃封闭2h。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待检血清用血清稀释液按1:40稀释。

8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述化学发光底物液为等体积比例的底物A溶液和底物B溶液，底物A溶液为化学发光增强剂，底物B溶液为鲁米诺。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述底物A溶液为0.01mmol/L IPP+2mmol/L的H₂O₂+体积分数为0.001％的Tween₂₀，溶剂为0.01mmol/L、PH＝7.0磷酸-柠檬酸盐缓冲液。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述底物B溶液为0.01mmol/L的鲁米诺+质量体积分数为0.01％的牛血清白蛋白+0.01mmol/L EDTA，溶剂为0.02mol/L、pH＝8.5的Tris缓冲液。