[发明专利]人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用

说明书

本发明提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用，属于医药技术领域。本发明用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，收集上清液，经过离心和超滤浓缩，得到浓缩液移至30％蔗糖重水密度垫上采用蔗糖密度离心进一步纯化，得到人脐带间质干细胞外泌体。本发明通过分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体有效降低免疫反应性，使用时保证剂量可控。所述人脐带间质干细胞外泌体通过提高二型糖尿病动物模型胰岛素信号通路的活化程度，抑制肝糖原合成分解，从而实现葡萄糖代谢稳态的调节，同时提高二型糖尿病动物模型对胰岛素的敏感性及胰岛β细胞的胰岛素分泌功能降低血糖浓度，实现制备治疗二型糖尿病的药物的应用。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus)是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。过去30多年，国内糖尿病的发病率由低于1％增长至超过10％，糖尿病患者人数已超过1亿，居全球第一，且不断趋于年轻化。糖尿病已成为我国严重的公共卫生问题。90％～95％的糖尿病患者为2型糖尿病(T2DM)，2型糖尿病患者早期通过控制饮食、增强运动及口服降糖药调节血糖，随着病情的发展，大多数患者需要长期依赖外源性胰岛素才能使血糖保持在正常范围，降糖药和胰岛素都存在大量不良反应如胃肠道应激、骨质疏松、低血糖、胰岛素注射部位皮下结节以及β细胞反馈性分泌功能丧失等，对于病情的控制及并发症的预防都存在不足，因此，亟需寻找降低糖尿病患者血糖，减轻治疗副作用并延缓糖尿病病情发展的新方法。

国内外诸多研究表明，间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在血糖调节和胰岛细胞功能修复方面具有重要的作用，MSC能提高外周组织对胰岛素的敏感性，使组织对血液中葡萄糖的利用增加，在糖尿病的干预方面表现出了一定的效果，但MSC的应用标准、免疫反应性、潜在致瘤性及转基因技术的安全性等因素使MSC的在糖尿病治疗中的应用受到限制。目前MSC在糖尿病的治疗中存在较多毒副作用，仅用于控制病情对于病因没有实质性的改善；还存在伦理，剂量不可控及安全性问题。

目前，外泌体与糖尿病的研究主要集中于疾病诊断，而用于糖尿病或糖代谢调控的仅有：Wen D等发现过表达anti-miR-375的骨髓MSC来源外泌体携带anti-miR-375抑制胰岛移植的宿主免疫排斥反应(J Controlled Release,2016,238:166-175)；棕色脂肪组织来源的外泌体能够转运miR-99b至肝脏调控FGF-21表达(Nature,2017,542(7642):450)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供人脐带间质干细胞外泌体(MSC-ex)的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用，分离纯化的人脐带间质干细胞外泌体对糖尿病的病因直接干预，具有安全性可控的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；

(2)将所述步骤(1)中人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；所述超滤用超滤膜为100000Da规格；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min；

(3)将所述步骤(2)中的浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；

(4)将所述步骤(3)中底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于100000Da MWCO超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。