[发明专利]一种痰液液化试剂、含有其的试剂盒及其应用

说明书

本发明提出一种痰液液化试剂，包括固定剂、液化液、玻璃珠、核酸外切酶缓冲液；所述固定剂中含有溶剂和聚合物，所述聚合物为聚天冬氨酸钠或聚‑L‑谷氨酸，所述液化液中含有还原剂和pH值为7.0～8.5的缓冲溶液。本发明还提出含有所述痰液液化试剂的试剂盒及其应用。本发明的痰液液化试剂从保留细胞与细菌完整性、提高痰液液化效率以及消除高分子DNA复合物等方面入手对痰液进行液化，液化后的痰液可以更好地满足微米级微流控芯片的分离细菌使用。本发明的试剂优势是能够缩短液化时间、提高液化效率，提高细菌分离效率、降低人细胞基因组DNA含量。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种痰液液化试剂的试剂或试剂盒的制备及应用。

背景技术

痰液中液体主要是由支气管粘膜上皮的分泌粘液的腺体和杯状细胞分泌的。正常情况下，杯状细胞和腺体分泌少量粘液覆盖在粘膜层表面，对粘膜起保护作用，可保持气管粘膜的湿润，以把吸入气管、支气管内的尘埃颗粒、细菌等粘附住，阻挡其进入肺组织深处，然后，再借助于纤毛柱状上皮的纤毛摆动，把它们排到气管上端的喉头部位，经口腔咯出。正常痰一般为无色透明，带有点粘性，略微粘稠，适量的痰液有助于滋润呼吸道，捕捉灰尘和微生物(粘液)。虽然任何咳出痰都可以被认为是异常的，但在没有任何呼吸系统病理改变下也能咳出或吐出少量的痰。然而，在某些情况下，特别是与呼吸道发炎有关，痰量可能会产生过多。在这些病理病例中，痰的颜色、质地甚至气味都可能发生变化。

当气管、支气管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而发生炎症时，呼吸道的粘膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血管扩张，渗出增加，粘膜层的杯状细胞和粘膜下层的腺体增生肥大，粘液分泌大量增多，有利于清除异物。粘液分泌过多，就加重了纤毛柱状上皮的负担，不利于粘液的排出，在细菌及其毒素的作用下，产生一些变性坏死组织细胞，潴留在支气管内，粘液和这些变性坏死的组织细胞就构成了痰，比正常痰来有两个特征：一是粘稠度更高，二是颜色也有可能由白色或灰色变为黄色、绿色、铁锈色或棕色，还也可能因为含有少量的血液，有血丝呈现。

根据痰液的粘稠度增加可以将痰简单分为有泡沫(浆液性)痰、粘液性痰和脓性痰。临床上根据吸痰过程中痰液在吸痰管玻璃接头处的性状及在玻璃管内壁的附着情况将痰液的粘稠度分为三度：1度：痰液如米汤或泡沫样，吸痰后玻璃接头内壁上无痰液滞留。2度：痰的外观较1度粘稠，吸痰后有少量痰液在玻璃接头内壁滞留，但容易被水冲净3度：痰的外观明显粘稠，呈黄色，吸痰管常因负压过大而塌陷，玻璃接头内壁上常滞留大量痰液且不易被水冲净。

痰液的粘稠度主要是由于痰中的酸性糖蛋白含量有关，由于糖蛋白分子依靠不同的键(如二硫键、氢键等)交叉联接在一起，形成一种凝胶网。痰液中的Ca²⁺含量高，可以增加粘稠度，显微镜下观察到的长纤维就是由这些粘多糖、黏蛋白构成。呼吸道感染时，由于大量炎症细胞的核破坏而产生的DNA被组蛋白及粘蛋白包裹，亦可使痰液的粘稠度显著提高，见于脓性痰，常呈粗平行纤维。

目前用于痰液液化方法主要包括蛋白酶法、还原法(DTT与乙酰半胱氨酸)及碱裂解法，这些方法都存着一定的缺点，其中蛋白酶法及碱裂解法导致痰液中细胞及病原菌损失较大，DTT法适用于细胞学检测，对保留细胞较好，但也存在着液化后静止沉淀物过过多，这些显微镜下呈现丝状或颗粒状的沉淀很容易易堵塞微流控芯片等微米级设备，从而导致上样体积及收集液量过少，不能满足实验要求。此外，坏死细胞释放的DNA由于被组蛋白及粘蛋白包裹而不能游离于上清液中，离心时会同细菌一起沉淀下来，导致分离获得细菌中还有大量人基因组DNA的存在。我们应用专利CN107090399A流控芯片分离痰液中细菌的实验结果也进一步证明了这一点：荧光显微镜观察侧通道收集液中没有Hoechst 33342染色的细胞及细胞核，但细菌基因组DNA与人基因组DNA比例变化很小甚至没有变化，这表明存在着大量的细胞坏死后释放的基因组DNA包裹于蛋白复合物，随离心而沉淀下来而不是游离于上清中，其次细菌也有可能于粘附或夹裹于丝状蛋白未能充分释放，在主通道随液流流走，导致细菌收集量减少。

发明内容