[发明专利]一种基于引物生成型滚环扩增技术的端粒酶活性检测方法

说明书

本发明提供一种基于引物生成型滚环扩增(PG‑RCA)技术的端粒酶活性检测方法，设计一个探针，端粒酶存在时，探针3'端不断增加端粒(TTAGGG)_n扩展，并与反向引物结合，在phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切割酶作用下启动SDA反应并生成RCA引物，RCA引物和圆形模板(CT)结合，在phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切割酶作用下触发线性RCA反应并生成新RCA引物，新RCA引物又与新CT结合，触发新一轮RCA反应，最终产生大量核酸扩增产物，被荧光染料SYBR Gold检测。该方法将检测信号两步放大具有超高的灵敏度，检测限低至3个Hela细胞，操作简单，无需繁琐的洗涤分离步骤。

技术领域

本发明属于生物分析技术,特别涉及一种基于端粒触发链置换放大介导的引物生成型滚环扩增反应检测端粒酶活性的荧光方法。

背景技术

端粒是真核染色体末端的一种特殊结构，由串联重复(TTAGGG)n组成。在正常的体细胞中，端粒长度在每个细胞分裂过程中都逐渐缩短。一旦端粒被缩短到一个临界长度，细胞衰老、凋亡和老化就不可避免地发生。这种端粒长度的缩短可以被端粒酶通过增加重复序列(TTAGGG)n到端粒末端来阻断。大量的研究表明，在正常的人类细胞中端粒酶活性降低或缺失，但在几乎所有癌症细胞(超过85％)中被高度激活，如肺癌，肝癌，胃癌，和结肠直肠癌。因此，端粒酶被认为是早期癌症诊断的潜在生物标志物。此外，端粒酶也是治疗癌症的重要靶标，各种各样的抑制端粒酶活性的化合物已经被开发成抗癌药物。因此，端粒酶的有效检测对生物研究和生物医学应用都具有重要的意义。

现有方法中，基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复扩增方法(TRAP)是最常用的检测端粒酶活性的方法，但是程序耗时、放射性材料污染、不实用是其无法克服的缺点。近年来又开发了一些新的方法来检测端粒酶的活性，例如等温核酸扩增法，电化学分析法，电化学发光检测法和以及荧光分析法。等温核酸扩增方法大大提高了实验的简单性，但其检测灵敏度不高，在优化条件下，可以检测低至50个癌细胞中的端粒酶活性；电化学分析法中，有报道指出，Lin等开发了一种基于免标记的电化学阻抗法来检测端粒酶活性，该检出限能够测定1000HeLa细胞中端粒酶的活性；电化学发光检测技术集合了电化学方法与化学发光法两者的优点，Xu等研发的一种电化学发光分析方法来分析端粒酶的活性，可以达到最低检测313个HL-60癌细胞，之后Xu等优化了该方法又设计了一种新颖的双电位ECL信号检测方法，其检测最低100个HL细胞提取的端粒酶活性；荧光分析法中，Majerska等设计了一种新颖的不需要使用放射性材料和高纯度端粒酶样品的免PCR端粒酶分析法—一种基于等温循环链置换聚合反应的荧光分析法，最低可检测到40个HeLa细胞中的提取的端粒酶活性。由此可见，上述方法均存在灵敏度有限的问题，因此，开发一种新的方法用于快速检测、灵敏、特异性的检测端粒酶活性的方法是目前急需解决的问题。

发明内容

为了克服上述技术中存在的不足，本方法提供一种基于端粒酶触发链置换放大介导的引物生成型滚环扩增技术(PG-RCA)检测端粒酶活性的方法。本发明将高效率的恒温指数扩增方法和滚环扩增方法相结合，将检测信号进行了两步放大，具有超高的灵敏度，因此本方案可以实现高效、灵敏地检测端粒酶的活性，检测限低至3个Hela细胞，并可特异性地区分端粒酶和其它蛋白；另外，本发明通过一个特殊探针将滚环扩增的引物自动生成，无需再单独设计滚环扩增引物，操作简单；整个操作过程无需繁琐的洗涤、分离步骤。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一个DNA单链探针在引物生成型滚环扩增(PG-RCA)技术检测端粒酶活性中的应用，所述探针列SEQ ID NO.1为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TACCTC ACC TCA GCT ACA ATC CGT CGA GCA GAG TT-3'；

该探针3'端为端粒酶底物序列，5'端为RCA底物序列，中间包含切割酶识别位点。