[发明专利]一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法：脐带预处理，物理破碎脐带，间充质干细胞分离，利用消化酶处理获得间充质干细胞，在含有10％胎牛血清和DMEM/F12细胞培养基的培养液中培养获得临床应用数量级的间充质干细胞；所述物理破碎脐带为用剪刀把处理后的脐带剪碎；所述消化酶为胶原酶Ⅱ溶液联合胰蛋白酶。本发明采用物理破碎联合消化酶的方法从脐带提取间充质干细胞，该扩增方法显著提高了间充质干细胞的扩增效率，而且使得间充质干细胞具有良好的细胞免疫学表型；提取的脐带间充质干细胞数量有了显著的提高，在相同的培养时间内，该培养方法获得的细胞数量相对较多。

技术领域

本发明涉及一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，通过采用体外扩增培养体系获得可以用于临床的间充质干细胞。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞可以自我复制，自我更新，刺激组织生长和修复，并且污染源低，获得方便，生物性能稳定、免疫源性更原始。在适宜的体外实验条件下，容易扩增和保存。间充质干细胞通过改变T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和树突样细胞分泌的细胞因子，使其体内的免疫细胞增殖，所以间充质干细胞在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景。

随着科学技术的不断进步，寻找新型和更具潜力的间充质干细胞已经成为当今研究热点。本发明从剖腹产胎盘组织中提取间充质干细胞，然后进行原代分离和培养，对间充质干细胞做细胞表型标志、增殖分化以及免疫调节能力等在内的性质鉴定。间充质干细胞可以促进组织修改，改善免疫，在临床上用于自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等均有明显疗效。如何获得足够数量的更具潜力的间充质干细胞是MSCs应用在临床上的重要保证，以期进一步拓宽人们对脐带间充质干细胞生物学性质的认识，并为这一类间充质干细胞的临床应用提供支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，材料来源易得、操作简单方便高效，能有效降低MSCs的培养成本和获得大量的MSC细胞，为MSCs在临床的应用提供基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法：脐带预处理，物理破碎脐带，间充质干细胞分离，利用消化酶处理获得间充质干细胞，在含有10％胎牛血清和DMEM/F12细胞培养基的培养液中培养获得临床应用数量级的间充质干细胞；所述物理破碎脐带为用剪刀把处理后的脐带剪碎；所述消化酶为胶原酶Ⅱ溶液联合胰蛋白酶。

进一步的，一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，具体步骤为：

a)脐带预处理

从保存液中取出脐带，物理破碎脐带，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血液和血块，用10倍双抗浸泡后用剪刀剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织碎块；

b)原代间充质干细胞分离

将剪碎的组织小块，用胶原酶Ⅱ溶液消化，后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化，终止消化后用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液，洗涤离心得到的沉淀物即为间充质干细胞，用培养液重悬，接种于六孔板内培养。

进一步的，步骤b中，分离的间充质干细胞按照1-3*106/ml密度接种于六孔板中，培养1-3天，根据细胞生长状态更换MSC细胞培养液。

进一步的，步骤b中，用胶原酶Ⅱ溶液消化12-24小时，后加入胰蛋白酶在37℃条件下消化15-30分钟，用含血清的完全培养基终止消化，用生理盐水洗两次，用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液。