[发明专利]一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：脐带预处理，物理破碎脐带，间充质干细胞分离，利用消化酶处理获得间充质干细胞，在含有10％胎牛血清和DMEM/F12细胞培养基的培养液中培养获得临床应用数量级的间充质干细胞；所述物理破碎脐带为用剪刀把处理后的脐带剪碎；所述消化酶为胶原酶Ⅱ溶液联合胰蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

a)脐带预处理

从保存液中取出脐带，物理破碎脐带，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血液和血块，用10倍双抗浸泡后用剪刀剪碎至0.5～2mm3，得到脐带组织碎块；

b)原代间充质干细胞分离

将剪碎的组织小块，用胶原酶Ⅱ溶液消化，后加入胰蛋白酶，在37℃培养箱中消化，终止消化后用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液，洗涤离心得到的沉淀物即为间充质干细胞，用培养液重悬，接种于六孔板内培养。

3.根据权利2所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中，分离的间充质干细胞按照1-3*106/ml密度接种于六孔板中，培养1-3天，根据细胞生长状态更换MSC细胞培养液。

4.根据权利2所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中，用胶原酶Ⅱ溶液消化12-24小时，后加入胰蛋白酶在37℃条件下消化15-30分钟，用含血清的完全培养基终止消化，用生理盐水洗两次，用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液。

5.根据权利2或3所述的一种从脐带中提取间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中，当间充质干细胞数量达到80％～90％融合度时，用胰蛋白酶消化传代转移到T25细胞培养瓶继续培养。