[发明专利]VZV糖蛋白E基因表达载体及其重组酵母菌株与应用

说明书

本发明公开了一种VZV(水痘‑带状疱疹病毒)糖蛋白E基因真核表达载体及其重组酵母菌株与应用，所述载体为α‑gE融合基因与pPink‑HC的连接体，α‑gE融合基因为VZV糖蛋白E的基因全序列和α信号肽的融合基因。本发明公开的毕赤酵母的表达系统中能够成功表达水痘‑带状疱疹病毒的糖蛋白E，为后续该蛋白免疫原性检测及在毕赤酵母中的高效表达以及水痘带状疱疹疫苗的研发奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体说，是涉及一种可用于表达VZV(水痘-带状疱疹病毒)糖蛋白E基因的表达载体及其重组酵母菌与应用。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)是疱疹病毒属(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科成员，是一种直径150～200nm的DNA病毒，形态学上是由核酸内心、蛋白衣壳和包膜构成的同心圆状结构，表面由162各壳微粒组成的对称正二十面体，有嗜皮肤和神经的特征，在幼儿及老年人群中多发病的一种双链DNA病毒，是一种发病快、传染性高的疾病。它可引起水痘和带状疱疹两种常见病，还可引起脑炎、肺炎等严重并发症；而患者痊愈后少量残存的病毒潜伏于体内的神经细胞中，待机体免疫力低下时又会大量繁殖，从而导致疼痛性的疾病带状疱疹(herpes zoster)。在免疫受损的个体中，VZV感染的发病率和病死率都很高。VZV引起的疾病及其相关后遗症已逐渐成为重要的公共卫生问题，并日益受到人们的重视。

VZV壳外有一层或多层的含脂蛋白的包膜，整个VZV基因组是一种包含有72个开放阅读框，约编码67种蛋白，能编码8种糖蛋白gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK以及gM的序列，其中糖蛋白E(glycoprotein E，gE)是一种晚期结构蛋白，分子量较大，由ORF68基因编码，属于Ⅰ型膜蛋白，是生成感染性病毒颗粒的必需糖蛋白也是病毒在感染细胞中含量最高、抗原性最强的糖蛋白，广泛存在于在VZV颗粒的表面和宿主细胞的细胞膜和胞质中，病毒包膜上的含量最高，是被免疫系统识别的第一个糖蛋白，能诱导细胞免疫和体液免疫。在病毒的不同成熟阶段以不同的含糖多肽形式存在，是体液免疫和细胞免疫应答的重要靶点。糖蛋白E包含623个氨基酸残基，包括两个抗原决定簇编码区e1和c1，在变异的VZV柱间这些抗原决定簇是稳定的，因此VZV糖蛋白E有稳定的表位，具有较高的保守性，是比较合适的疫苗抗原候选单位。其中gE而在处于恢复期的水痘和带状疱疹的患者血清中，VZV抗体最主要的针对gE，其诱导机体产生体液免疫以及细胞免疫，从而保护个体抵抗病毒的感染。一般情况下，利用原核表达系统表达的蛋白往往会出现由于缺少二硫键的形成、磷酸化以及糖基化修饰、加工作用，使得最后表达的蛋白以无活性或者活性较低的包涵体形式存在，这对蛋白的表达以及后续的纯化都是很大的障碍。KR100434023B1公开了以动物细胞系表达一种大数量的一种糖蛋白的水痘-带状疱疹病毒(VZV)。具体是通过一种双顺反子表达载体，plced4gpiis，含有一种基因编码一种蛋白gpiis，其是通过除去的疏水性位点产生在所述羧基-末端的一种VZV的糖蛋白，GPⅡb，由第六百九十九至第八百六十八氨基酸，和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，在其两个基因是通过一个启动子调节。该动物细胞系的CHO(中国仓鼠卵巢)-gpiis#3(KCTC～2A13abp)是通过转化的细胞系的CHO产生与所述双顺反子表达载体plced4gpiis。以及用于表达该表面抗原糖蛋白的方法，具体为：培养该动物细胞线CHO(中国仓鼠卵巢)-gpiis#3(KCTC～2A13abp)的培养基中含有methotreaxate(MTX)；增加该浓度的MTX在该介质通过步骤以诱导该本发明的表达DHFR基因和gpiis基因；和分离所表达的蛋白gpiis从所培养的培养基。该方法主要是通过动物细胞系表达，该表达系统价格昂贵，生产成本高且周期长。CN102517302A公开了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用。该方法是将去除跨膜区和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。该表达方法有助于提高目的蛋白的表达量，简化了下游的纯化工作，可较容易地实现蛋白的规模化生产，且批间质量稳定。以本发明重组蛋白作为捕获抗原可用于血浆样本中抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的间接ELISA检测，可提高临床诊断VZV感染的准确性，并用于其它需要VZV特异性免疫球蛋白进行高通量检测的领域。此方法为原核表达且主要用于VZV感染检测，并不适用制备VZV免疫组合物。李福民等人公开了一种用PCR方法扩增VZV糖蛋白E基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1并用双酶切和测序方法鉴定。结果扩增的目的基因包括了全长的糖蛋白E基因，长度约1.9kb；并且成功构建了糖蛋白E基因重组表达载体(实用医院临床杂志，Practical Journal of ClinicalMedicine，2006年02期，ISSN：1672-6170)。伊兴旭等人公开了一种构建含有VZV g E胞外域基因的真核表达质粒p CDNA3.1-g E，测序后脂质体转染COS-7细胞，经G418筛选出稳定表达VZV gE的细胞株。采用RT-PCR法检测VZV gE的mRNA，Western blot和间接免疫荧光法检测gE的免疫反应性，表达产物经Ni2+-NTA柱纯化后包被ELISA板，对127份0～10岁正常儿童血清中VZV-Ig G抗体水平进行检测。结果成功筛选出能够稳定表达VZV gE胞外域基因的COS-7细胞株，RT-PCR检测到gE的mRNA，经Western blot和间接免疫荧光鉴定，gE具有明显的免疫反应性，COS-7细胞株和其培养上清液中均有gE融合蛋白，表达量约为0.632mg/mL，纯度约为90％。ELISA实验检测了127份0～10岁儿童血清中VZV-Ig G抗体，总阳性率为81.89％，特异度和灵敏度分别为93.75％和88.24％(安徽医科大学学报，ActaUniversitatis Medicinalis Anhui，2015年03期，ISSN：1000-1492)。李春明等人公开了一种用Oka株VZV(VZV-Oka)感染人二倍体细胞(2BS株)，提取基因组DNA，以其为模板，PCR扩增gE537目的片段，克隆至载体pCI-neo，构建重组真核表达质粒p CI-neo-g E537-His。大量扩增后提取质粒，转染293FT细胞，瞬时表达，经镍柱纯化，获得目的蛋白gE537-His，Western blot和ELISA法进行鉴定。结果经双酶切及测序鉴定，重组真核表达质粒pCIneo-gE537-His构建成功。200mmol/L咪唑洗脱液为洗脱目的蛋白的最佳咪唑浓度。纯化产物可与鼠抗gE糖蛋白单抗于相对分子质量约90 000处发生特异性结合，且可与mAb-10、mAb-12抗gE单抗发生反应(中国生物制品学杂志，Chinese Journal of Biologicals，2016年11期，ISSN：1004-5503)。伊兴旭公开了一种VZVgE基因胞外域的克隆、表达方法，具体为：从临床采集带状疱疹患者的皮肤囊泡液接种至单层人胚胎成纤维细胞(human embryofibroblast，HF)，进行病毒分离；对分离的病毒株进行特征性细胞病变效应(Cytopathiceffect，CPE)，间接免疫荧光和DNA测序鉴定。将确认的VZV临床分离株体外培养，PCR扩增VZV g E基因胞外域片段，分别构建原核表达质粒g E-p ET-32a(+)和真核表达质粒g E-pCDNA3.1/myc-His(-)，测序后将原核质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导，获得VZV g E原核表达的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳、Western blot鉴定融合蛋白的特异性，利用Ni2+-NTA柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。将真核质粒用脂质体介导转染至COS-7细胞，经G418筛选出稳定表达VZV g E蛋白的细胞株，表达产物经Ni2+-NTA柱纯化；通过RT-PCR检测VZV g E基因的m RNA，Western blot和间接免疫荧光检测g E融合蛋白的免疫反应性。分别用纯化后的原核表达g E蛋白和真核表达g E蛋白免疫新西兰家兔，获得兔抗VZV g E多克隆抗体(安徽医科大学，硕博论文)。上述表达方法均是通过动物细胞系表达，该表达系统价格昂贵，生产成本高且周期长。