[发明专利]VZV糖蛋白E基因表达载体及其重组酵母菌株与应用

权利要求书

1.VZV糖蛋白E基因表达载体，其特征在于：所述载体为α-gE融合基因与pPink-HC的连接体，其中α-gE融合基因为VZV糖蛋白E的基因全序列和α信号肽的融合基因。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述α-gE融合基因如SEQ ID NO：6所示。

3.用于表达VZV糖蛋白E基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体通过如下方法构建：

步骤A、设计引物，根据gE基因序列和pPink-HC上的多克隆位点序列分别设计引物，以实现在目标基因片段两端分别添加EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切位点；

步骤B、构建重组载体，将扩增后gE基因片段和pPink-HC经双酶切后连接，将连接产物经培养挑选阳性克隆子经测序鉴定正确后即得。

4.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，步骤A引物设计为：F引物5'端设有EcoRI酶切位点，R引物5'端设有Sph Ⅰ酶切位点，且引物XF、XR进行PCR扩增α信号肽，GF、GR进行PCR扩增gE，X-GF、X-GR进行PCR扩增α-gE融合基因。

5.VZV糖蛋白E基因表达载体，其特征在于，所述表达载体通过如下步骤获得：

步骤a、根据如SEQ ID NO：1所示的经密码子优化后的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的基因全序列、毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mix和/或α信号肽上的多克隆位点序列设计引物XF、XR、GF、GR、X-GF和X-GR，F引物5'端设有EcoRI酶切位点，R引物5'端设有Sph Ⅰ酶切位点；引物XF、XR扩增α信号肽和GF、GR进行PCR扩增gE后，将所得PCR产物以gE片段和α信号肽片段为模板，引物X-GF、X-GR进行PCR扩增，PCR产物再经胶回收α-gE融合基因片段；

步骤b、再将步骤a所得α-gE融合基因片段与pPink-HC分别扩增回收后，再分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切后回收酶切片段，将经酶切后的gE片段与pGAPZαA混合经T4连接酶连接得一连接产物，再将所得连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，再挑取阳性克隆子进行菌落PCR扩增，即得该重组表达载体；

其中，引物XF序列如SEQ ID NO：2所示，引物XR序列如SEQ ID NO：3所示；引物GF序列如SEQ ID NO：4所示，引物GR序列如SEQ ID NO：5所示；引物X-GF序列如SEQ ID NO：2所示，引物X-GR序列如SEQ ID NO：3所示。

6.一种VZV糖蛋白E基因表达载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤A、设计引物，根据gE和pPink-HC上的多克隆位点序列分别设计引物，以实现在目的片段两端分别添加EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切位点；

步骤B、融合α-gE基因序列，以gE原始序列在不改变氨基酸序列的前提下进行密码子优化；均以pGAPZαA-mix为模板，分别以引物XF、XR扩增α信号肽和以GF、GR扩增gE；再以gE片段和α信号肽片段为模板，引物X-GF、X-GR进行融合PCR扩增α-gE融合基因；

步骤C、构建重组载体，分别以步骤B所得α-gE融合基因和pPink-HC为模板进行扩增，反应后的PCR产物经胶回收试剂盒回收；将回收片段和pPink-HC经限制性内切酶EcoR Ⅰ和SphⅠ进行双酶切完全后，胶回收酶切片段；将回收后gE片段与pPink-HC混合经T4连接酶16℃连接过夜；再将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp抗性的平板上，37℃培养过夜；挑取阳性克隆子进行菌落PCR，酶切鉴定后测序分析鉴定；即完成该表达载体的构建，所得重组表达载体命名为pHC-gE，即酵母重组子。

7.一种可表达gE的重组酵母株，其特征在于：所述酵母株为表达如SEQ ID NO：1所示的VZV糖蛋白E的基因全序列的酵母株Pichia pinkTM S1。